BML-111對(duì)野百合堿致大鼠肺組織白介素-1β和組織因子的影響

陳永梅，張昭勇，陳 玲，龔興瑞，向 勇

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科1、麻醉科2，湖北 十堰 442000)

BML-111對(duì)野百合堿致大鼠肺組織白介素-1β和組織因子的影響

陳永梅1，張昭勇1，陳 玲1，龔興瑞2，向 勇2

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科1、麻醉科2，湖北 十堰 442000)

目的觀察脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111處理對(duì)野百合堿(MCT)導(dǎo)致大鼠肺動(dòng)脈壓力的改變情況。方法SD大鼠36只，按照隨機(jī)的原則分為C組、P組和B組，每組各12只，P組和B組皮下注射野百合堿50μg/g，C組皮下注射相等容量的生理鹽水，B組腹腔注射1 mg·kg-1·d-1BML-111持續(xù)28 d。測(cè)量三組SD大鼠的平均肺動(dòng)脈壓力(MPAP)、右心室收縮壓(RVSP)及右心室(RV)/[左室(LV)+室間隔(S)]比值，記錄肺組織白介素1β(IL-1β)和組織因子(TF)的水平。結(jié)果P組和B組大鼠的MPAP、RVSP、RV/(LV+S)、肺組織IL-1β及TF水平均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組大鼠的MPAP、RVSP、RV/(LV+S)、肺組織IL-1β及TF水平均低于P組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111可有效抑制野百合堿導(dǎo)致的大鼠肺動(dòng)脈壓力升高，其原理可能與減輕肺組織IL-1β及TF水平有關(guān)。

BML-111；野百合堿；白介素-1β；組織因子

肺動(dòng)脈壓力升高在臨床比較常見(jiàn)，其原因多種多樣，但是其本質(zhì)仍然是肺血管結(jié)構(gòu)和生理功能的紊亂，表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓力的逐漸升高，并最終導(dǎo)致右心衰竭和死亡。肺動(dòng)脈高壓危害如此之大，但是其發(fā)生機(jī)制并不清楚，預(yù)后不良，需要進(jìn)一步的探索其發(fā)生發(fā)展機(jī)理[1]。隨著該疾病研究的深入，炎癥方面的影響正逐步得到關(guān)注，炎癥因素可以導(dǎo)致肺血管功能紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖，平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生，并最終引起肺部細(xì)小動(dòng)脈管腔狹窄，肺血管病變形成[2]。野百合堿(MCT)是一種較常用的致肺部炎物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠肺動(dòng)脈血管病變并管腔狹窄，越來(lái)越多的被用來(lái)制作炎癥性肺動(dòng)脈高壓模型[3]。BML-111是一種脂氧素類似物，它與血管內(nèi)的受體結(jié)合后可抑制炎癥反應(yīng)，減少血管炎癥相關(guān)性重塑，其藥理作用特點(diǎn)可能成為較好的肺動(dòng)脈高壓治療藥物。此試驗(yàn)擬觀察BML-111對(duì)MCT致大鼠肺動(dòng)脈高壓大鼠的作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心訂購(gòu)雄性健康SD大鼠36只，體重200～230 g。實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備包括：天平、注射器、壓力換能器、水合氯醛、肝素、氟哌利多等大鼠試驗(yàn)用器械。MCT購(gòu)自Sigma公司，白介素-1β(IL-1β)和組織因子(TF)酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肺動(dòng)脈高壓模型建立 實(shí)驗(yàn)分組及方法同前[4]，將36只大鼠平均分為C組、P組、B組，每組各12只。P組和B組大鼠皮下注射野百合堿50 mg/kg，C組注射相等容量生理鹽水作為對(duì)照建立模型；繼之B組腹腔注射1 mg·kg-1·d-1BML-111持續(xù)28 d。于大鼠MCT給藥前，給藥后第7天、第14天、第21天、第28天測(cè)量大鼠體重。

1.2.2 肺動(dòng)脈壓力測(cè)量 取10 cm硬膜外導(dǎo)管末端加熱拉伸，并使其彎曲，用注射器注水驗(yàn)證導(dǎo)管通暢作為肺動(dòng)脈壓力測(cè)量用。4周時(shí)大鼠體制測(cè)量完畢后對(duì)大鼠進(jìn)行壓力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，麻醉大鼠采用水合氯醛腹腔注射,劑量為3 ml/100 g(100 ml水合氯醛+ 5 mg氟哌利多)。麻醉后固定大鼠于手術(shù)臺(tái)，分離右側(cè)頸外靜脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎靜脈，近端插入提前制作好的預(yù)先充滿肝素鹽水的右心導(dǎo)管，聯(lián)接至監(jiān)護(hù)儀并察看壓力數(shù)值及波形，當(dāng)導(dǎo)管進(jìn)入右心室壓力穩(wěn)定后記錄其右室收縮壓(RVSP)，監(jiān)護(hù)儀出現(xiàn)肺動(dòng)脈波形時(shí)，待其壓力穩(wěn)定后，記錄平均肺動(dòng)脈壓力(MPAP)，每個(gè)壓力值測(cè)量3次，每次間隔3 min。壓力測(cè)量完畢后處死大鼠，游離右室(RV)和左室+室間隔(LV+S)并稱重。

1.2.3 炎癥因子的測(cè)定 在肺動(dòng)脈壓力測(cè)量完成后處死大鼠并取肺組織保存于-80℃冰箱。炎性因子檢測(cè)時(shí)將肺組織勻漿后按照試劑盒要求，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)肺組織IL-1β和TF水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對(duì)各組大鼠體重變化的比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，對(duì)血流動(dòng)力學(xué)改變和肺肺部炎癥因子的情況采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況 P組有兩只大鼠于第3周死亡。四周結(jié)束后，P組和B組大鼠與C組比較，進(jìn)食減少、少動(dòng)，生長(zhǎng)較慢，且P組比B組更嚴(yán)重。三組大鼠之間體重增長(zhǎng)速度存在差異，C組增長(zhǎng)最快，B組次之，P組最慢(F=6.2，P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠體重變化比較(g，±s)

表1 三組大鼠體重變化比較(g，±s)

注：a表示與C組比較，P＜0.05；b表示與P組比較，P＜0.05。

組別C組P組B組28 d 330±15 253±14a290±14ab0 d 202±9 206±10 204±9 7 d 238±12 218±10a222±11a14 d 272±13 230±11a250±12ab21 d 305±13 241±12a272±12ab

2.2 血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果 大鼠處死后發(fā)現(xiàn)，P組和B組大鼠MPAP(qP：C=11.2，qB：C=5.2)、RV/(LV+S)(qP：C= 14.6，qB：C=7.2)、RVSP(qP：C=9.8，qB：C=4.6)均較C組升高，且P組比B組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠的MPAP、RVSP及RV/(LV+S)比較(±s)

表2 三組大鼠的MPAP、RVSP及RV/(LV+S)比較(±s)

注：a表示與C組比較，P＜0.05；b表示與P組比較，P＜0.05；1 mmHg= 0.133 kPa。

組別RV/(LV+S) MPAP（mmHg）RVSP（mmHg）C組P組B組17.2±2.2 34.6±5.8a26.9±4.5ab19.2±3.6 54.6±8.8a41.2±8.1ab0.223±0.024 0.395±0.036a0.312±0.031ab

2.3 IL-1β和TF含量 P組和B組大鼠肺組織IL-1β(qP：C=21.4，qB：C=12.2)和TF(qP：C=16.3，qB：C=9.6)含量相比C組增高，且P組比B組增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠肺組織IL-1β和TF的含量比較(pg/ml，±s)

表3 三組大鼠肺組織IL-1β和TF的含量比較(pg/ml，±s)

注：a表示與C組比較，P＜0.05；b表示與P組比較，P＜0.05。

測(cè)量指標(biāo)TF IL-1β19.8±6.4 53.6±10.2a38.8±8.4abC組P組B組67.5±17.6 256.8±70.4a144.47±47.8ab

3 討 論

臨床有眾多疾病最后發(fā)展成為肺動(dòng)脈高壓，其過(guò)程較長(zhǎng)，為治療提供了時(shí)機(jī)，但是機(jī)制不清楚為臨床治療埋下了隱患。隨著認(rèn)識(shí)的越來(lái)越深入，炎癥因素正得到越來(lái)越多的認(rèn)可，諸如白細(xì)胞浸潤(rùn)、白介素釋放、腫瘤壞死因子釋放等。這些炎癥介質(zhì)是導(dǎo)致肺血管發(fā)生形態(tài)學(xué)改變的基礎(chǔ)，如果對(duì)炎癥不加以控制，任由其發(fā)展，各種因素很快導(dǎo)致并最終形成肺動(dòng)脈高壓[5-8]。因此從調(diào)控機(jī)體自身炎癥反應(yīng)途徑來(lái)控制炎癥反應(yīng)具有重要意義。脂氧素是機(jī)體自身存在的促炎消退介質(zhì)，作用于其受體可發(fā)揮抗炎作用，因此運(yùn)用這條途徑調(diào)控炎癥反應(yīng)具有重要意義，由于其在體內(nèi)作用時(shí)間短暫，因此采用其受體激動(dòng)劑BML-111，可發(fā)揮相似作用。本實(shí)驗(yàn)中采用較為常用的皮下注射MCT的方法成功制作大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，實(shí)驗(yàn)期間大鼠在注射MCT后，P組大鼠生長(zhǎng)速度明顯減慢，MPAP、RV/(LV+S)、RVSP相比C組升高說(shuō)明P組大鼠出現(xiàn)了肺動(dòng)脈高壓。由ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺組織IL-1β和TF含量均較正常對(duì)照組升高，說(shuō)明MCT注射后誘發(fā)大鼠肺組織產(chǎn)生了明顯的炎癥反應(yīng)；而B組大鼠在MCT注射后，4周內(nèi)連續(xù)采用1 mg·kg-1·d-1劑量的BML-111腹腔注射，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MPAP、RV/(LV+S)、RVSP升高幅度小于P組，進(jìn)一步說(shuō)明BML-111具有抑制MCT誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈壓力升高的作用。ELISA分析發(fā)現(xiàn)B組大鼠肺組織IL-1β和TF的升高幅度與P組相比明顯減輕，說(shuō)明B組肺動(dòng)脈壓力升高較小的原因可能與BML-111減輕肺組織IL-1β和TF水平有關(guān)，減輕了炎癥所導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)，與Wang等[5]研究結(jié)果相一致，通過(guò)TNF-α阻斷劑可有效抑制肺動(dòng)脈高壓，進(jìn)一步說(shuō)明了炎癥反應(yīng)在肺動(dòng)脈高壓形成中具有重要作用[1]。

IL-1β是機(jī)體重要的炎性介質(zhì)，它可以激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)，在肺動(dòng)脈高壓大鼠體內(nèi)升高，同時(shí)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。具體過(guò)程與TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、金屬基質(zhì)蛋白酶表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，并最終導(dǎo)致血管增生重構(gòu)[10]。TF作為外源性凝血途徑的啟動(dòng)因子啟動(dòng)凝血途徑在肺動(dòng)脈高凝狀態(tài)和微血栓形成具有重要作用，抗凝治療可改善肺動(dòng)脈高壓患者病情[11]。但是其更為重要的作用是促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖而非改變凝血狀態(tài)[12]。已有不少關(guān)于TF介導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的研究[13-14]，因此采用IL-1β和TF觀察MCT處理后大鼠肺部炎癥變化情況是可靠的。

由MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型比較成熟，其病理改變包括平滑肌細(xì)胞增生，成纖維細(xì)胞激活并浸入血管中膜、內(nèi)膜，并釋放血管活性物質(zhì)，動(dòng)脈血管收縮障礙，動(dòng)脈壁增厚，并最終產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓[5]，結(jié)果可靠，是常用的建立肺動(dòng)脈高壓的模型的方式。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111通過(guò)減輕肺組織炎癥反應(yīng)相關(guān)因子IL-1β和TF，抑制MCT誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈壓力升高的速度，減輕大鼠肺血管結(jié)構(gòu)改變程度。其通過(guò)抑制炎癥從而改善肺動(dòng)脈高壓作用為臨床治療肺動(dòng)脈高壓提供了理論支持，具有較好應(yīng)用前景。

[1]Dorfmuller P,Perros F,Balabanian K,et al.Inflammation in pulmonary arterial hypertension[J].Eur Respir J,2003,22(2)：358-363.

[2]Humbert M,Montani D,Perros F,et al.Endothelial cell dysfunction and cross talk between endothelium and smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension[J].Vascul Pharmacol,2008,49(4-6)：113-118.

[3]Gomez-Arroyo JG,Farkas L,Alhussaini AA,et al.The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2012,302(4)：363-369.

[4]龔興瑞,陳永梅,向 勇,等.脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111對(duì)左向右分流型肺動(dòng)脈高壓大鼠作用的影響[J].海南醫(yī)學(xué),2013,24(2)：160-162.

[5]Wang Q,Zuo XR,Wang YY,et al.Monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension is attenuated by TNF-alpha antagonists via the suppression of TNF-alpha expression and NF-kappaB pathway in rats[J].Vascul Pharmacol,2012,58(1-2)：71-77.

[6]Price LC,Wort SJ,Perros F,et al.Inflammation in pulmonary arterial hypertension[J].Chest,2012,141(1)：210-221.

[7]Kherbeck N,Tamby MC,Bussone G,et al.The Role of inflammation and autoimmunity in the pathophysiology of pulmonary arterial hypertension[J].Clin RevAllergy Immunol,2011,44(1)：31-38

[8]Sakao S,Tatsumi K,Voelkel NF.Endothelial cells and pulmonary arterial hypertension：apoptosis,proliferation,interaction and transdifferentiation[J].Respir Res,2009,10(1)：1-10.

[9]Pinto RF,Higuchi ML,Aiello VD.Decreased numbers of T-lymphocytes and predominance of recently recruited macrophages in the walls of peripheral pulmonary arteries from 26 patients with pulmonary hypertension secondary to congenital cardiac shunts[J].Cardiovasc Pathol,2004,13(5)：268-275.

[10]Roy S,Samanta K,Chakraborti T,et al.Role of TGF-beta1 and TNF-alpha in IL-1beta mediated activation of proMMP-9 in pulmonary artery smooth muscle cells：involvement of an aprotinin sensitive protease[J].Arch Biochem Biophys,2011,513(1)：61-69.

[11]Berger G,Azzam ZS,Hoffman R,et al.Coagulation and anticoagulation in pulmonary arterial hypertension[J].Isr Med Assoc J, 2009,11(6)：376-379.

[12]Cirillo P,Cali G,Golino P,et al.Tissue factor binding of activated factorⅦ triggers smooth muscle cell proliferation via extracellular signal-regulated kinase activation[J].Circulation,2004,109(23)：2911-2916.

[13]White RJ,Galaria II,Harvey J,et al.Tissue factor is induced in a rodent model of severe pulmonary hypertension characterized by neointimal lesions typical of human disease[J].Chest,2005,128(6 Suppl)：612-613.

[14]White TA,Witt TA,Pan S,et al.Tissue factor pathway inhibitor overexpression inhibits hypoxia-induced pulmonary hypertension [J].Am J Respir Cell Mol Biol,2010,43(1)：35-45.

Effect of BML-111 on IL-1β and TF in pulmonary tissue of rats induced by monocrotaline.

CHEN Yong-mei1, ZHANG Zhao-yong1,CHEN Ling1,GONG Xing-rui2,XIANG Yong2.Department of Clinical Laboratory1,Department of Anesthesiology2,Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo analyzes the effect of BML-111 in treatment of pulmonary arterial hypertension induced by monocrotaline(MCT).MethodsThirty-six SD rats were randomly divided into three groups(C group,P group and B group),with 12 rats in each group.Both P group and B group were processed subcutaneous injection of 50 μg/g monocrotaline,while C group received same volume of saline.B group was additionally treated with intraperitoneal injection of 1 mg·kg-1·d-1BML-111 from the day of monocrotaline injection.Mean pulmonary arterial pressure(mPAP),right ventricular systolic pressure(RVSP),ratio of right ventricle to the sum of left ventricle and interventricular septum[RV/(LV+S)],the pulmonary interleukin-1β(IL-1β)and tissue factor(TF)were observed and assayed.ResultsThe levels of MPAP,RVSP,RV/(LV+S),pulmonary IL-1βand TF in P and B groups were significantly higher than those in C group(P＜0.05),and the levels in B group were significantly lower than those in P group (P＜0.05).ConclusionBML-111 can improve pulmonary arterial hypertension,which may be attributed to the inhibitory the inflammation of pulmonary tissue.

BML-111;Monocrotaline;Interleukin-1β(IL-1β);Tissue factor

R-332

A

1003—6350（2015）11—1566—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.11.0561

2014-12-06)

十堰市科技局指導(dǎo)項(xiàng)目（編號(hào)：ZD20111016）

陳永梅。E-mail：346822733@qq.com