B細胞轉錄激活因子、維甲酸相關孤兒核受體γt對急性哮喘小鼠氣道炎癥的影響

陳菊屏，原淑莉，張 明，王文軍，范賢明

(瀘州醫學院附屬醫院呼吸內二科，四川 瀘州 646000)

B細胞轉錄激活因子、維甲酸相關孤兒核受體γt對急性哮喘小鼠氣道炎癥的影響

陳菊屏，原淑莉，張 明，王文軍，范賢明

(瀘州醫學院附屬醫院呼吸內二科，四川 瀘州 646000)

目的 探討B細胞轉錄激活因子(BATF)、白細胞介素-17及維甲酸孤兒核受體γt(RORγt)對急性哮喘小鼠氣道炎癥的影響。方法(1)將24只健康雌性BALB/c小鼠隨機分為生理鹽水對照組(NS組)、哮喘模型組(AS組)、地塞米松治療組(DEX組)，每組8只。第0、7、14天，AS組、DEX組小鼠用卵清蛋白(OVA)抗原液腹腔內注射致敏，NS組用等體積生理鹽水腹腔內注射。第21天起，NS組超聲霧化吸入生理鹽水，AS組、DEX組超聲霧化吸入2%的OVA液，均為每天1次，每次40 min，連續5 d。每次霧化前30 min，DEX組以地塞米松1.0 mg/kg腹腔注射，NS組、AS組則以等體積的生理鹽水腹腔注射。末次霧化結束24 h后，各組小鼠留取肺組織標本進行檢測。結果(1)肺組織切片顯示：NS組肺組織無明顯炎癥反應，AS組及DEX組均存在炎癥反應，且AS組炎癥反應明顯高于DEX組。(2)免疫組化結果顯示：AS組肺組織BATF、IL-17、RORγt的表達明顯高于NS組、DEX組(P＜0.05)；DEX組肺組織IL-17、BATF、RORγt的表達較AS組明顯降低(P＜0.05)。(3)肺組織BATF的表達與BALF中白細胞(WBC)總數及中性粒細胞(NEU)計數、嗜酸性粒細胞(EOS)計數呈正相關(r=0.487、0.531、0.515，P＜0.05)；肺組織BATF的表達與IL-17、RORγt的表達呈正相關(r=0.502、0.493，P＜0.05)；肺組織IL-17的表達與RORγt的表達呈正相關(r=0.536，P＜0.05)。結論(1)急性哮喘小鼠肺組織中BATF、IL-17、RORγt表達上調。(2)地塞米松可能是通過下調BATF、IL-17、RORγt的表達而減輕氣道炎癥性損害。

支氣管哮喘；白細胞介素17；B細胞轉錄激活因子；維甲酸孤兒核受體γt；氣道炎癥

支氣管哮喘(Bronchial asthma，簡稱哮喘)是呼吸系統的常見疾病，由多種細胞和細胞組份參與，氣道炎癥及氣道高反應性(AHR)為其重要特征[1]。哮喘的確切發病機制尚未闡明；糖皮質激素類藥物在哮喘治療方面作用顯著，但其作用途徑亦不甚明確。B細胞活化轉錄因子(BATF)、白細胞介素-17(IL-17)、維甲酸相關核孤兒受體γt(Retinoic acid-related orphan receptor，RORγt)近年研究較多的炎癥因子，本研究以哮喘模型小鼠為研究對象，觀察BATF、IL-17、RORγt與哮喘及地塞米松之間的關系，進一步探討哮喘的發病機制及對哮喘治療的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及哮喘動物模型的制備 24只SPF級健康雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重15～18 g，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，按照隨機數字表法隨機分為生理鹽水對照組(NS組)、哮喘模型組(AS組)、地塞米松治療組(DEX組)，每組8只。AS組、DEX組小鼠分別于第0、7、14天用卵清蛋白(OVA，美國Sigma公司)原液100 μg加1 mg氫氧化鋁及生理鹽水配置成200 μl混懸液，4℃冰箱放置30 min后腹腔內注射致敏，NS組用等量0.9%的生理鹽水進行腹腔注射。第21天開始AS組、DEX組小鼠分別置于自制的30 cm×40 cm×40 cm大小的透明封閉箱內，以2%的OVA超聲霧化吸入30～40 min，每天1次，連續5 d，NS組則予以等量生理鹽水同頻次霧化[2]。DEX組于每次霧化前30 min，予以地塞米松1.0 mg/kg(湖北頂輝化工有限公司)腹腔注射，NS組、AS組則予以等體積生理鹽水腹腔注射，時間同上。

1.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集及檢查 各組小鼠末次激發結束24 h后，分別予戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，用1 ml注射器行氣管插管，注入37℃生理鹽水0.5 ml，反復抽吸肺泡灌洗液(BALF)，重復3次，回收率均在80%以上，離心BALF取上清轉移到EP管中，-20℃冰箱保存待檢。光學顯微鏡下進行白細胞(WBC)、中性粒細胞(NEU)及嗜酸性粒細胞(EOS)計數。

1.3 小鼠肺組織病理切片、染色及BATF、IL-17、RORγt表達的檢測 取右肺組織制備病理切片，HE(蘇木素-伊紅)染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。使用免疫組織化學法檢測左肺組織IL-17、BATF、RORγt的表達。石蠟包埋組織，常規脫蠟、切片，抗原修復后行內源性過氧化物酶封閉，分別加IL-17A兔抗人多克隆抗體(購于北京博奧森生物有限技術公司)、BATF兔抗人多克隆抗體(購于NOVUS BIOLOGICALS)及RORγt兔抗人多克隆抗體(購于北京博奧森生物有限技術公司)過夜，加二抗(bs-0360R試劑盒，購于北京博奧森生物有限技術公司)，按試劑盒說明步驟操作。以普通光鏡觀察切片，胞漿呈棕褐色或棕黃色為陽性。利用彩色圖文分析系統進行圖像分析及數據采集，隨機測量每高倍鏡視野下積分吸光度(IA)，以IA的值反映切片中陽性物質的表達水平。

1.4 統計學方法 全部數據采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，相關分析采用雙變量相關分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠哮喘模型的氣道炎癥改變

2.1.1 各組小鼠肺組織形態學改變 NS組小鼠肺組織鏡下可見支氣管管腔光滑、規則，氣道上皮完整，黏膜皺襞低平，管壁平滑肌較薄，管腔內未見明顯分泌物。AS組支氣管管腔狹窄，管壁增厚，多處氣道上皮斷裂、脫落，氣道黏膜增生肥厚，纖毛結構紊亂，較多炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增厚明顯，管腔內可見大量黏液堆積；DEX組的上述表現較AS組減輕，但較NS組明顯。

2.1.2 各組小鼠BALF中WBC總數、PMN計數及EOS計數比較 與NS組比較，AS組及DEX組BALF中白細胞總數、中性粒細胞數及嗜酸性粒細胞數明顯增多(P＜0.01)；DEX組BALF中白細胞總數、中性粒細胞數及嗜酸性粒細胞數較AS組明顯減少(P＜0.01)，見表1。

表1 各組小鼠BALF中WBC總數、NEU及EOS計數比較(±s,×104/ml)

表1 各組小鼠BALF中WBC總數、NEU及EOS計數比較(±s,×104/ml)

注：a表示與NS組比較，P＜0.01；b表示與AS組比較，P＜0.01。

NS組AS組DEX組1.13±0.84 6.00±0.93a2.50±0.93ab8 8 8 4.88±1.25 20.50±0.93a9.25±1.04ab0.88±0.84 5.25±0.89a2.88±0.84ab

2.2 各組小鼠肺組織BATF、IL-17、RORγt的表達 鏡下可見AS組、DEX組小鼠支氣管上皮細胞及肺泡上皮細胞顯示IL-17、BATF、RORγt表達的陽性顆粒明顯多于NS組；與AS組比較，DEX組顯示IL-17、BATF、RORγt表達的陽性顆粒明顯減少(如圖1)；積分吸光度分析提示差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 相關性分析 肺組織BATF的表達與BALF中WBC總數及NEU計數、EOS計數呈正相關(r=0.487、0.531、0.515，P＜0.05)；肺組織BATF的表達與IL-17、RORγt的表達呈正相關(r=0.502、0.493，P＜0.05)；肺組織IL-17的表達與RORγt的表達呈正相關(r=0.536，P＜0.05)。

表2 各組小鼠肺組織BATF、IL-17和RORγt的表達比較(±s)

表2 各組小鼠肺組織BATF、IL-17和RORγt的表達比較(±s)

注：a表示與NS組比較，P＜0.05；b表示與AS組比較，P＜0.05。

組別 只數BATFIL-17RORγt NS810.00±5.1335.50±8.6031.13±11.30 AS827.75±9.10a81.75±17.30a79.75±18.45aDEX817.88±7.06ab49.38±9.15ab45.25±8.51ab

圖1 NS組、AS組和DEX組小鼠肺組織BATF、IL-17及RORγt免疫組化染色(×400)

3 討論

哮喘是一種炎癥性疾病，炎癥細胞及相關細胞因子參與其中。糖皮質激素是目前臨床用于控制哮喘急性發作、延長哮喘緩解周期最重要的藥物之一，其治療哮喘的主要作用是抑制哮喘的氣道炎癥、氣道黏液高分泌及氣道高反應。本研究發現，AS組小鼠氣道炎癥表現明顯，BALF中炎癥細胞明顯增多，伴隨BATF、IL-17、RORγt表達顯著增加，說明BATF、IL-17、RORγt參與了哮喘氣道炎癥的發生、發展。而在DEX組，肺組織的氣道炎癥表現較哮喘組明顯減輕，BALF中炎癥細胞亦減少，同時伴有BATF、IL-17、RORγt表達顯著下降，說明當BATF、IL-17、RORγt受到抑制時，氣道炎癥會隨之減輕，進一步表明炎癥因子BATF、IL-17、RORγt確實有促進哮喘發病的作用。

B細胞轉錄激活因子(B cell activating transcription factor，BATF)是堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，屬于激活蛋白1(AP-1)超家族中的一員[3]。BATF與氣道炎癥密切相關。BATF(+/+)小鼠可被OVA致敏出現氣道高反應、黏液分泌增加、IgE水平增高及氣道肥大細胞增多，而BATF(-/-)小鼠表現則相反[4]。BATF表達增多導致兒童哮喘病理生理反應增加，阻斷BATF表達可改善哮喘兒童病理生理反應。BATF可調節淋巴細胞和肥大細胞參與的哮喘免疫應答。研究表明，BATF受IL-6調控，繼而影響Th17細胞，從而致哮喘發生發展。另有研究也證實BATF可致Th17生成增加[5]。進一步的研究表明BATF激活可致RORγt表達增加，從而促進Th17分化致哮喘發展。上述研究與本試驗相一致。

孤兒核受體家族是核受體超家族中較獨特的成員，沒有確定的配體[6]，能通過調節基因參與免疫、炎癥反應。視黃酸相關孤兒核受體(RORγt)是孤兒核受體的一種，是Th17的轉錄因子。哮喘發生時，Th17細胞在氣道大量聚集并產生IL-17。研究發現哮喘發生時，RORγt增高，Th17亦增高，伴隨IL-17產生增多，同時哮喘病理生理反應亦明顯。當RORγt表達受到抑制時，Th17數量亦下降，伴隨IL-17減少，同時哮喘病理生理反應亦得到控制[7-8]。與本實驗所得結果一致。

IL-17是一種強大的炎癥因子，主要由Th17細胞產生[9-10]。在哮喘的表達明顯增高，IL-17能刺激成纖維細胞、上皮及內皮細胞釋放IL-6、IL-8、前列腺素E2(PGE2)、基質金屬蛋白酶MMP、細胞間粘附分子(ICAM-1)。研究發現，哮喘患者氣道IL-17增加，可誘導成纖維細胞刺激Th17細胞生成更多的IL-17。在兒童哮喘患者氣道亦發現Th17及RORγt表達增加。另有研究發現，煙曲霉誘發氣道高反應的小鼠所表達的IL-17是增加的，而不能誘發氣道高反應的小鼠所表達的IL-17是明顯減少的[11]。蟑螂變應原介導的哮喘中IL-17的表達亦增高[12]。因此，IL-17參與了氣道高反應及哮喘的發生，與本實驗相吻合。

急性哮喘小鼠肺組織中BATF、IL-17、RORγt表達上調，且三者的表達一致。地塞米松可能是通過下調BATF、IL-17、RORγt的表達而減輕氣道炎癥性損害及哮喘癥狀，最終達到抑制氣道炎癥的效果。BATF、IL-17、RORγt參與了哮喘的發生發展，針對BATF、IL-17、RORγt靶向藥物將是我們研究治療哮喘的又一個新的方向。

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Effects of B cell activating transcription factor,retinoic acid-related orphan nuclear receptor γt on acute airway inflammation in asthmatic mice.

CHEN Ju-ping,YUAN Shu-li,ZHANG Ming,WANG Wen-jun,FAN Xian-min.The 2ndDepartment of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000, Sichuan,CHINA

Objective To study the role of the B cell activating transcription factor(BATF),IL-17 and the retinoic acid-related orphan nuclear receptor(RORγt)in acute airway inflammation of asthmatic mice.Methods(1)Twenty-four healthy female BALB/c mice were randomly divided into the normal saline group(NS group),the asthma group(AS group),and the dexamethasone group(DEX group),with 8 mice in each group.On days 0,7 and 14,ovalbumin(OVA)fluid was injected into the abdominal cavity of the mice in AS group and DEX group,and normal saline was injected into the abdominal cavity of the mice in NS group.From the 21stday,the mice in NS group were inhaled normal saline with 40 minutes of ultrasonic atomization once a day for five consecutive days,while the mice in AS group and DEX group were inhaled 2%OVAsolution in the same way.The mice in DEX group were given intraperitoneal injection of dexamethasone(1.0 mg/kg)at 30 minutes before the inhalation each time,and the mice in other groups were given the normal saline group in the same way.24 hours after the final inhalation,mice were collected the lung tissue samples for testing.Results(1)According to lung tissue sections,lung tissue in NS group had no significant inflammation,while the lung tissue in AS and DEX groups showed inflammation response.AS group's inflammatory response was higher than DEX group's.(2)Immunohistochemistry results showed the expression of BATF,IL-17 and RORγt in AS group were higher than that in NS group and DEX group(P＜0.05),and the expression in DEX group was significantly lower than the AS group(P＜0.05).(3)The expression of BATF in lung tissue was positively correlated with the count of WBC,NEU and EOS in the BALF differently(r=0.487,0.531,0.515,P＜0.05).The expression of BATF in lung tissue was positively correlated with the one of RORγt and IL-17 differently(r=0.502, 0.493,P＜0.05).The expression of IL-17 in lung tissue was positively correlated with the one of RORγt(r=0.536,P＜0.05).Conclusion(1)The expression of BATF,IL-17 and RORγt in AS group's lung tissue was increased significantly.(2)Dexamethasone could down-regulate the expression of BATF,IL-17 and RORγt in asthmatic mice,which would improve airway inflammatory.

Bronchial asthma;IL-17;B cell activating transcription factor(BATF);Retinoic-acid-related orphan nuclear receptor(RORγt);Airway inflammation

R-332

A

1003—6350（2015）07—0937—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0337

2014-10-21)

四川省衛生廳資助項目(編號：120328)；四川省學術和技術帶頭人培養資金(編號：川財社[2013]176號)

范賢明。E-mail：fxm129@163.com