臨床三種常規糞便隱血實驗的方法學評估

楊勇文，李從榮，李 艷，袁樂永

(武漢大學人民醫院檢驗醫學中心，湖北 武漢 430000)

臨床三種常規糞便隱血實驗的方法學評估

楊勇文，李從榮，李 艷，袁樂永

(武漢大學人民醫院檢驗醫學中心，湖北 武漢 430000)

目的 對匹拉米洞法、血紅蛋白單克隆抗體法(單克隆抗體法)和轉鐵蛋白(Tf)/血紅蛋白(Hb)聯合免疫法(聯合免疫法)進行性能評估。方法通過300例臨床樣本和不同的動物血紅蛋白(Hb)、維生素C(VitC)進行檢測，從靈敏度、干擾性實驗、反應時間等檢測指標來反映三種方法的檢驗效能。結果匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法檢測Hb最低濃度分別為2.5μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml，聯合免疫法檢測Tf的最低濃度為0.05μg/ml。匹拉米洞法可以和人以及不同動物的血紅蛋白反應，單克隆抗體法和聯合免疫法只對人的血紅蛋白反應；Vit C不會對單克隆抗體法和聯合免疫法產生影響，一定的Vit C會使匹拉米洞法產生假陰性結果。三種方法的反應時間分別為17 s、26 s、24 s。匹拉米洞法檢測上消化道隱血組、下消化道隱血組和對照組的陽性率分別為95.1%、73.7%、10.8%；單克隆抗體法分別為74.4%、94.7%、2.5%；聯合免疫法分別為90.2%、100%、6.7%。結論匹拉米洞法、單克隆抗體法、聯合免疫法對不同部位的消化道隱血的檢測相輔相成，各具特點。三種方法聯合檢測對消化道疾病的輔助診斷具有重要的意義。

糞便隱血；聯合免疫；單克隆抗體；匹拉米洞

隱血是指消化道少量出血，紅細胞被消化破壞，糞便外觀改變無異常，肉眼和顯微鏡均不能證實的出血。糞便隱血實驗(Fecal occult blood test，FOBT)對消化道出血的診斷具有重要價值，是目前慢性消化出血性疾病、早期發現和診斷消化道惡性腫瘤的一個篩查指標。化學法和免疫法是目前臨床上較常用的兩類方法，本研究采用的化學法是匹拉米洞法，免疫法則包括血紅蛋白單克隆抗體法(單克隆抗體法)和轉鐵蛋白(Tf)/血紅蛋白(Hb)聯合免疫法(聯合免疫法)。化學法靈敏度適中，但易受藥物、動物血等因素影響，而免疫法具有高靈敏度、高特異性的特點，但在方法學和其他方面的缺陷導致實際臨床運用過程中出現一些不足[1]。因此新出現的免疫法并不能完全取代傳統的化學法。本研究通過對匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法進行初步性能評估，探討該三種方法的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年8月至2014年9月武漢大學人民醫院300例住院患者糞便樣本，其中120例為臨床確診消化道隱血患者的糞便樣本(包括82例為上消化道隱血樣本，38例為下消化道隱血樣本)，180例為常規糞便樣本(臨床未診斷有任何消化道疾病的樣本)。

1.2 試劑與方法 匹拉米洞法采用珠海貝索公司提供的貝索糞便隱血Ⅱ號試紙(FeceOB-II)，單克隆抗體法采用萬華普曼生物工程有限公司提供的單克隆抗體試劑盒。聯合免疫法采用萬華普曼生物工程有限公司提供的聯合免疫法試紙。將上消化道隱血樣本、下消化道隱血樣本和臨床未診斷有任何消化道疾病的樣本分別設定為上消化道隱血組，下消化道隱血組和對照組。采用匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法分別對這三組標本進行平行檢測。操作和結果判讀按照各自的說明書進行。

1.3 靈敏度實驗 取已知Hb濃度的人全血質控品，用蒸餾水稀釋成含Hb 2 000μg/ml、1 000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml 16種濃度的Hb混懸液，用上述三種方法分別測定；取已知濃度的Tf，用蒸餾水稀釋成2μg/ml、1μg/ml、0.4μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.04μg/ml、0.02μg/ml 7種濃度的轉鐵蛋白懸液，用聯合免疫法測定。

1.4 抗干擾實驗 在含Hb 500μg/ml與250μg/ml的大便混懸液中分別加入50mg/ml、25mg/ml、20mg/ml、10 mg/ml、7.5 mg/ml、5 mg/ml 6種不同濃度的Vit C；收集鴿、雞、鴨、豬、兔、狗6種動物全血，分別制成1 000μg/ml、500μg/ml、200μg/ml、20 ug/ml、12μg/ml、6μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/m l8種Hb混懸液。用上述三種方法測定。

1.5 反應時間 從3種試劑中隨機抽取10份，分別測同一份約含Hb 3.5μg/ml的糞便樣本。匹拉米洞法以滴加顯色劑(3%過氧化氫)后計時，單克隆抗體法、聯合免疫法以加樣區開始接觸樣本后開始計時，待液體滲透至控制線并且出現肉眼可見的顏色后記錄終末反應時間。取三種方法分別測試10份標本后的平均時間作為各自的反應時間。

1.6 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種方法檢測人全血Hb靈敏度的比較 單克隆抗體法和聯合免疫法的檢測靈敏度高(0.1μg/ml)；Hb濃度在250～500μg/ml內反應較強，結果容易判斷；Hb濃度＞1 000μg/ml，反應結果不易判斷。匹拉米洞法靈敏度為2.5μg/ml，見表1。

2.2 干擾性實驗

2.2.1 不同動物的不同濃度Hb對三種方法檢測結果的比較 匹拉米洞法試劑可以與不同動物Hb發生反應，檢測Hb的最低濃度為2.5μg/ml；單克隆抗體法和聯合免疫法試劑不與各種動物Hb反應。

2.2.2 不同Vit C濃度對三種檢測方法結果的影響 單克隆抗體法和聯合免疫法不受任何濃度Vit C影響；當Hb濃度為0.25 mg/ml，Vit C濃度＞5 mg/ml時，匹拉米洞法結果為陰性；當Hb濃度為0.5 mg/ml時，Vit C濃度＞7.5 mg/ml時，匹拉米洞法結果為陰性，見表2。

表1 三種隱血試驗法檢測人全血Hb靈敏度的比較

表2 VitC對三種大便隱血實驗結果的影響

2.3 三種檢測方法檢測反應時間比較 匹拉米洞法，單克隆抗體法和聯合免疫法的反應時間分別為17 s、26 s、24 s。

2.4 三種隱血實驗陽性率比較 上消化道隱血組中，匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法的陽性率分別為95.1%、74.4%、90.2%；匹拉米洞法和單克隆抗體法差異有統計學意義(χ2=13.639，P＜0.05)，單克隆抗體法和聯合免疫法差異有統計學意義(χ2= 7.079，P＜0.05)；下消化道隱血組中，匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法的陽性率分別為73.7%、94.7%、100%；，匹拉米洞法和聯合免疫法差異有統計學意義(χ2=11.515，P＜0.05)，單克隆抗體法和聯合免疫法差異有統計學意義(χ2=6.333，P＜0.05)。對照組匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法檢測的陽性率10.8%、2.5%、6.7%，匹拉米洞法和單克隆抗體法差異有統計學意義(χ2=6.696，P＜0.05)。

3 討論

近年來，隨著國人的生活方式不斷西化和飲食習慣的改變，消化系統疾病特別是結直腸癌的發病率逐年上升；糞便隱血實驗是作為常規篩查手段，能夠較早的發現消化系統疾病的相關臨床癥狀，有效的降低其患病率和死亡率[2-3]。

匹拉米洞法利用血紅蛋白中的亞鐵血紅素所具有的過氧化物酶活性，催化過氧化氫，放出新生態氧，將受體試劑氧化變色，并且顏色的深淺與隱血的含量成正比關系[4]。一方面，在患者就診前，如果服用大量的VitC或者其他具有還原性物質，將還原過氧化氫而出現假陰性結果；另一方面，匹拉米洞法常因食物或藥物中亞鐵離子的影響出現假陽性。匹拉米洞法檢測具有敏感度適中、顯色反應穩定、價格低廉等優點[5]。免疫法的檢測原理為雙抗體夾心法即：通過特異的人Hb或Tf單克隆抗體包被纖維素薄膜，與糞便中人的Hb或Tf特異地結合，再利用膠體金標記的抗人Hb或Tf抗體進行顯色反應[6]。免疫法具有較高的特異性和敏感性，所需的樣本量比匹拉米洞法更少并且沒有飲食和藥物上的限制[7]。但是，免疫法在方法學存在缺陷即：如果抗原或抗體過量以及血紅蛋白分子發生變性時，單克隆抗體法將出現假陰性結果；而聯合免疫法結合了轉鐵蛋白的穩定性，能夠避免單克隆抗體法的部分缺陷(血紅蛋白分子發生變性時也可以檢出)，是檢測消化道出現隱血較為理想的方法[8]。

在三種隱血試驗法檢測人全血Hb靈敏度的比較中，我們發現單克隆抗體法和聯合免疫法檢測的靈敏度(0.1μg/ml)比匹拉米洞法靈敏度高(2μg/ml)，因此，免疫法適合檢測消化道微量出血。本研究發現免疫法主要存在的問題是假陰性。對于單克隆抗體法而言，如果血紅蛋白在胃部珠蛋白鏈被酸迅速水解或者在小腸被蛋白酶降解，血紅蛋白可能被充分降解或消失殆盡而失去單克隆抗體所特異結合的抗原決定簇；在體外或胃腸道內細菌的作用也可使糞便中的血紅蛋白免疫活性喪失[9]，此時檢測結果為陰性。而轉鐵蛋白在消化道中的性質非常穩定，聯合免疫法能夠檢測微量的轉鐵蛋白(0.05μg/ml)來彌補單克隆抗體法的不足。當然，如果患者并發遺傳性Tf缺乏癥、尿毒癥、風濕性關節炎等疾病時，導致Tf含量較低，聯合免疫法也出現假陰性結果，此時應參考單克隆抗體法的結果進行判斷。當Hb濃度(＞1 000μg/ml)過高，單克隆抗體法和聯合免疫法的檢測結果均為陰性(這是因為抗原過多出現的后帶現象)[10]。此時應該參考可以檢測出高濃度Hb的匹拉米洞法。總之，免疫法的高敏感性對消化道疾病早期的微量出血具有獨特的預報作用，但是免疫法因消化道出血量大而出現假陰性時，應參考匹拉米洞法結果判斷。

從干擾性實驗的結果分析來看，不同動物的不同濃度Hb達到2.5μg/ml濃度時，都會對匹拉米洞法造成干擾，產生假陽性結果。正常人24 h生理性失血量約為0.6 ml，三種方法都可能會出現假陽性結果，值得臨床工作者注意。匹拉米洞法檢測出的動物血的血紅蛋白濃度與人的血紅蛋白濃度基本上一致，因此匹拉米洞法檢測血紅蛋白的種屬特異性差。Vit C對匹拉米洞法有很強的干擾作用[11]。免疫法對Hb和VitC都不反應，免疫法的特異性和抗干擾能力強[8]。此外，匹拉米洞法的反應時間比免疫法短。

匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法檢測上消化道出血組的陽性率分別為95.1%、74.4%、90.2%；匹拉米洞法、聯合免疫法與單克隆抗體法陽性率的差異有統計學意義(P＜0.05)，說明匹拉米洞法和聯合免疫法相對于單克隆抗體法來說，匹拉米洞法和聯合免疫法在檢測上消化道隱血更具優勢。在下消化道出血組中，匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法的陽性率分別為73.7%、94.7%、100%；聯合免疫法、單克隆抗體法和匹拉米洞法的陽性率差異有統計學意義(P＜0.05)，說明單克隆抗體法和聯合免疫法相對于匹拉米洞法來說，單克隆抗體法和聯合免疫法更適合下消化道隱血的輔助診斷。在對照組中，匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法檢測的陽性率分別為10.1%、2.7%、6.5%，匹拉米洞法與單克隆抗體法陽性率差異有統計學意義(P＜0.05)，說明匹拉米洞法假陽性率相對較高。因此，我們應該充分利用聯合免疫法的敏感度和特異度，來減少匹拉米洞法的假陽性和單克隆抗體法的假陰性。

綜上所述，匹拉米洞法簡便、易于操作、敏感性適中(2.5μg/ml)、特異度相對較差且容易被各種因素干擾。單克隆抗體法和聯合免疫法的敏感度高，可以檢測出0.1μg/ml的血紅蛋白濃度；特異性強，可以直接檢測出人的Hb。免疫法被世界衛生組織和世界胃腸鏡檢查協會推薦作為糞便隱血試驗的一種較為確認的方法[12]。在臨床工作中我們建議同時應用匹拉米洞法、單克隆抗體法和聯合免疫法法。當三種方法出現不同情況的矛盾結果時，我們應該相互結合它們的優缺點以及其他檢測指標，進行綜合判斷。

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Assessment of three kinds of routine detection methods for occult blood test.

YANG Yong-wen,LI Cong-rong,LI Yan, YUAN Le-yong.Center of Laboratory Medicine,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430000,Hubei,CHINA

Objective To evaluate the performance of pyramidon chemical method,hemoglobin monoclonal antibody(monoclonal antibody)and transferring(Tf)/hemoglobin(Hb)combined immunoassay(combined immunoassay).MethodsBased on detection of 300 clinical specimens,Hb and vitamin C of different animals,the performances of the three kinds of methods were assessed by indicators of sensitivity,interference experiment,and reaction time.ResultsThe lowest detected concentration of Hb for pyramidon chemical method,monoclonal antibody and combined immunoassay was 2.5 μg/ml,0.1 μg/ml,0.1 μg/ml,respectively.The lowest detected concentration of combined immunoassay for Tf was 0.05 μg/ml.Monoclonal antibody and combined immunoassay only responsed to human hemoglobin,but pyramidon chemical method could react with hemoglobin and other common animals.Vit C did not affect monoclonal antibody and combined immunoassay,but it would make certain pyramidon assay to produce false negative results.The reaction time of the three methods were 17 s,26 s,24 s,respectively.The positive rate for the detection of upper gastrointestinal hemorrhage group,lower gastrointestinal hemorrhage group,the normal group were 95.1%,73.7%,10.8%by pyramidon chemical method,74.4%,94.7%,2.5%by monoclonal antibody,and 90.2%, 100%,6.7%by combined immunoassay.ConclusionPyramidon assay,monoclonal antibody assay,combined immunoassay has its own advantages for the detection of different parts of the digestive tract hemorrhage.Combined detection of the three methods for auxiliary diagnosis of digestive tract diseases has important significance.

Fecal occult blood;Combined immunoassay;Monoclonal antibody;Pyramidon

R446.13+3

A

1003—6350（2015）07—0998—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0356

2014-10-16)

國家臨床重點專科（編號：2010305）

楊勇文。E-mail：yangyongwen1991@163.com