右美托咪啶預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及鈣循環(huán)調(diào)控蛋白的影響

李 霞，彭碧文，董 航

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000；2.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430000)

右美托咪啶預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及鈣循環(huán)調(diào)控蛋白的影響

李 霞1，2，彭碧文1，董 航2

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430000；2.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430000)

目的 觀察右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及心肌細(xì)胞鈣循環(huán)調(diào)控蛋白蘭尼堿受體(RyR2)和肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)的影響。方法45只大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(Sham組)，缺血再灌注組(I/R組)，右美托咪定預(yù)處理組(DEXM組)。DEXM組在缺血前2 h經(jīng)腹腔注射右美托咪定100 μg/kg。監(jiān)測(cè)各組大鼠缺血30 min及再灌注120 min的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)估心功能，以伊文氏藍(lán)-紅四氮唑(TTC)染色法測(cè)定心肌梗死面積，以實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)心肌組織RyR2和SERCA2a的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果I/R組心肌梗死面積(41.5±2.9)%，DEXM組心肌梗死面積(30.8±3.1)%，DEXM組梗死面積明顯低于I/R組(P＜0.05)。與Sham組及缺血前比較，I/R組和DEXM組缺血30 min及再灌注120 min時(shí)，HR、LVDP、±dP/dt均顯著降低(P＜0.05)，LVEDP顯著升高(P＜0.05)。I/R組和DEXM組相比，DEXM相LVDP、±dP/dt均高于I/R組(P＜0.05)，LVEDP低于I/R組(P＜0.05)。I/R組和DEXM組心肌組織中RyR2和SERCA2a的mRNA水平均較Sham組降低(P＜0.05)，但DEXM組RyR2和SERCA2a的mRNA水平高于I/R組。結(jié)論缺血再灌注前給予右美托咪定預(yù)處理可減小心肌梗死面積，促進(jìn)心肌細(xì)胞鈣循環(huán)，改善心功能，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

右美托咪定；預(yù)處理；缺血再灌注損傷

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織在短期缺血恢復(fù)血供后，出現(xiàn)較再灌注前更為嚴(yán)重的心肌結(jié)構(gòu)與功能的損傷。心肌缺血再灌注損傷是臨床麻醉工作中常見病理過(guò)程，也是圍術(shù)期意外發(fā)生的主要原因之一。右美托咪定(Dexmedetomidine)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的新型高選擇性腎上腺素α2受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮等效應(yīng)。研究顯示右美托咪定對(duì)心血管有多方面的保護(hù)作用，本研究擬觀察右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)肌漿網(wǎng)鈣循環(huán)的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性成年SD大鼠45只(購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重200～250 g，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham組)、缺血再灌組(I/R組)、右美托咪定預(yù)處理組(DEXM組)，每組各15只。

1.2 缺血再灌注損傷模型 大鼠禁食12 h后，以3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，行氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量3.0 ml/kg，呼吸比2:1，頻率60～70次/min。以針形電極刺入大鼠四肢皮下，連接多道電生理記錄儀電極行心電監(jiān)護(hù)。于左側(cè)第四肋間開胸，剪開心包暴露心臟。左心耳下方2 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，缺血30 min后松開結(jié)扎線再灌注120 min。DEXM組在缺血前2 h經(jīng)腹腔注射右美托咪定100 μg/kg(4 μg/ml)。I/R組則于缺血前2 h腹腔注射等體積生理鹽水，Sham組只穿心功能檢測(cè)。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)評(píng)估心功能 暴露右頸總動(dòng)脈，將心導(dǎo)管經(jīng)頸總動(dòng)脈插入左心室，外端接壓力換能器連接于多道生理記錄儀上，記錄血流動(dòng)力學(xué)變化波型存儲(chǔ)于電腦以備后續(xù)分析。以心率(HR)、左室舒張壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室舒張室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dP/dt)評(píng)價(jià)心功能。

1.4 心肌梗死面積測(cè)定 每組各取5只動(dòng)物采用伊文氏藍(lán)-紅四氮唑(TTC)染色法測(cè)定心肌梗死面積。向左室注入4 ml 2%伊文氏藍(lán)后取心臟切除心房及右室，沿室間溝將左室切為1～2 mm的薄片5～6片，置于1%TTC溶液15 min。心肌薄片染成深紅色部分是正常組織，染成白色部分為壞死組織。拍照后經(jīng)圖像分析軟件計(jì)算梗死面積，即梗死區(qū)面積/左心室組織切片總面積×100%。

1.5 肌漿網(wǎng)鈣泵和蘭尼堿受體mRNA檢測(cè) 用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)心肌組織蘭尼堿受體(RyR2)和肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)的mRNA水平。PCR引物設(shè)計(jì)用 Premier5.0軟件，RyR2引物(F：5'-CCAGTGGGACAGACTGGTGA，R：5'-GCCTTATCCATGCCCA GTAA)，SERCA2a引物(F：5'-TCTGACTTTCGTTGGCTGTC，R：5'-GCCTTTGTTATCCCCAGTG)，內(nèi)參GAPDH (F：5'-CAACGACCCCTTCATTGACC，R：5'-GAAGA CGCCAGTAGACTCCA)。按Trizol試劑盒說(shuō)明書提取心肌組織總RNA，按TAKARA試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA存于-20℃冰箱。實(shí)時(shí)定量PCR在ABI 7500系統(tǒng)中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。條件如下：起始退火溫度95℃，進(jìn)行30 s，然后按照95℃5 s，60℃45 s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌梗死面積的影響 再灌注120 min后每組隨機(jī)取5只大鼠心臟行心肌梗死面積檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)I/R組梗死面積為(41.5±2.9)%，DEXM組梗死面積為(30.8±3.1)%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心功能的影響 心導(dǎo)管記錄三組動(dòng)物缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。造模前，Sham組、I/R組、DEXM組HR、LVDP、LVEDP、±dP/dt差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。I/R組和DEXM組，缺血30 min及再灌注120 min時(shí)，HR、LVDP、±dP/dt均較缺血前及Sham組顯著降低(P＜0.05)，LVEDP則顯著升高(P＜0.05)。與I/R組相比，缺血30 min及再灌注120 min時(shí)，DEXM組LVDP、±dP/dt明顯高于I/R組(P＜0.05)，LVEDP低于I/R組(P＜0.05)，見表1。

2.3 右美托咪定預(yù)處理對(duì)RyR2和SERCA2a的影響 再灌注120 min后取梗死周邊區(qū)心肌組織，以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定RyR2、SERCA2a的mRNA表達(dá)水平。與Sham組比，I/R組和DEXM組心肌組織中RyR2和SERCA2a的mRNA水平均顯著下降(P＜0.05)。與I/R組相比，DEXM組RyR2和SERCA2a的mRNA水平高于I/R組，見圖1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心功能指標(biāo)比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)心功能指標(biāo)比較(±s，n=10)

注：與同組缺血前及SHAM組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；與I/R組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05，1 mmHg=0.133 kPa。

組別Sham組I/R組DEXM組時(shí)間點(diǎn)缺血前缺血30 min再灌注120 min缺血前缺血30 min再灌注120 min缺血前缺血30 min再灌注120 min HR(bpm) 382±34 363±67 378±58 371±52 333±46a320±40a363±47 342±61a348±88aLVDP(mmHg) 126.5±21.6 121.4±18.8 120.3±22.5 128.6±18.9 68.4±25.5a61.0±16.3a 125.0±27.3 93.6±21.4ab100.8±26.2abLVEDP(mmHg) 8.4±2.5 8.0±1.9 8.7±2.7 9.0±3.8 14.3±2.7a16.9±3.4a8.7±2.5 11.3±2.1ab10.0±2.2ab+dP/dtmax(mmHg/s) 4511.2±473.7 4657.2±389.5 4804.5±440.6 4467.8±505.0 3689.6±465.1a3543.3±477.3a4735.5±543.8 4114.2±489.8ab4432.3±435.0ab-dP/dtmax(mmHg/s) 4317.6±392.8 4449.3±486.4 4630.2±511.2 4287.0±443.5 3435.0±457.9a3673.4±530.1a4540.3±476.6 4012.4±396.3ab4287.5±469.7ab

圖1 各組間心肌組織RyR2和SERCA2a的mRNA水平

3 討論

1986年有學(xué)者觀察到缺血預(yù)處理，即在再灌注前反復(fù)短暫缺血，可以減小心肌梗死面積，減少再灌注心律失常，改善心功能。然而反復(fù)多次阻斷冠狀動(dòng)脈勢(shì)必增加血管損傷的風(fēng)險(xiǎn)，于是可發(fā)揮保護(hù)心臟作用的藥物預(yù)處理成為防治缺血再灌注損傷的研究重點(diǎn)。右美托咪啶作為一種臨床上廣泛運(yùn)用的新型鎮(zhèn)痛麻醉藥物，對(duì)心、腦、腎等多個(gè)臟器有廣泛的保護(hù)作用[1]。研究表明右美托咪啶通過(guò)增強(qiáng)迷走神經(jīng)興奮性，降低心肌耗氧，改善血管舒縮功能，發(fā)揮保護(hù)心血管保護(hù)作用[2-3]。本研究建立缺血再灌注大鼠模型，以右美托咪啶預(yù)處理研究其心肌保護(hù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)右美托咪定可減小心肌梗死面積，改善心臟舒縮功能，可增加心肌組織RyR2和SERCA2a的mRNA表達(dá)水平，提示右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。

有研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可降低缺血-再灌注損傷大鼠心肌組織Toll樣受體4/和NF-κB的mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)[4-5]。右美托咪啶亦可通過(guò)激活MEK/ERK1/2，PI3K/Akt信號(hào)通路，減輕心肌缺血再灌注損傷[6]。以右美托咪定預(yù)處理干預(yù)離體大鼠心臟缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)右美托咪定可以改善線粒體功能，促進(jìn)缺血前線粒體ATP敏感性鉀通道，抑制再灌注早期線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開發(fā)[7]。

RyR2和SERCA2a在心肌細(xì)胞鈣循環(huán)及心肌收縮中發(fā)揮重要作用。鈣離子經(jīng)心肌細(xì)胞膜鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與肌漿網(wǎng)RyR2結(jié)合，使鈣離子從肌漿網(wǎng)釋放，鈣離子與肌鈣蛋白結(jié)合引起心肌細(xì)胞收縮，完成興奮-收縮耦聯(lián)，然后細(xì)胞內(nèi)鈣離子被SERCA2a重新攝回入肌漿網(wǎng)，或被鈉鈣交換體泵出胞外，使心肌細(xì)胞進(jìn)入舒張狀態(tài)。缺血再灌注損傷引起RyR2和SERCA2a活性降低，誘發(fā)鈣超載，加重心肌損傷[8]。本研究顯示右美托咪定預(yù)處理，可以提高RyR2和SERCA2a的mRNA水平，抑制鈣超載，進(jìn)而減輕心肌損傷，改善心功能。

綜述所述，右美托咪定預(yù)處理可發(fā)揮心肌保護(hù)作用，減輕缺血再灌注損傷，這一發(fā)現(xiàn)提示右美托咪定可更安全地用于臨床麻醉中圍術(shù)期的心肌保護(hù)。

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Protective effects of dexmedetomidine preconditioning in rats with myocardial ischemia reperfusion injury and the effects on calcium regulatory proteins.

LI Xia1,2,PENG Bi-wen1,DONG Hang2.1.School of Basic Medical Sciences,Wuhan University,Wuhan 430000,Hubei,CHINA;2.Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan 430000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the protective effects of dexmedetomidine preconditioning in rats with myocardial ischemia reperfusion injury and the effects of dexmedetomidine on myocardium ryanodine receptor (RyR2)and sarcoplasmic reticIlum Ca2+-ATPase(SERCA2a).MethodsForty-five rats were randomly divided into three groups,sham operation group(Sham group),ischemia-reperfusion group(I/R group)and dexmedetomidine preconditioning group(DEXM group).2 h before left anterior descending coronary artery clamped,DEXM group received dexmedetomidine 100 μg/kg by intraperitoneal injection.The hemodynamic parameters were measured at the time of ischemia 30 min and reperfusion 120 min.The infarct size of myocardial tissues was determined by TTC staining.The mRNA level of RyR2 and SERCA2a were detected by the Real-time PCR.ResultsThe infarct size was (41.5±2.9)%in I/R group,which was significantly higher than(30.8±3.1)%in DEXM group(P＜0.05).Compared with the Sham group and the baseline before ischemic,heart rate(HR),left ventricular diastolic pressure(LVDP)and±dP/ dt decreased and the left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)increased in both I/R group and DEXM group at the time of ischemia 30 min and reperfusion 120 min(P＜0.05).Compared with the I/R group,LVDP and±dP/dt were higher,and LVEDP was lower in the DEXM group.Compared with the Sham group,the mRNA level of RyR2 and SERCA2a were smaller in the I/R group and DEXM group,which were higher in DEXM group than in I/R group.ConclusionDexmedetomidine preconditioning could attenuate myocardial ischemia reperfusion injury in rats via decreasing infarct size,improving cardiac function and increasing the mRNAlevel of RyR2 and SERCA2a.

Dexmedetomidine;Preconditioning;Ischemia reperfusion injury

R542.2

A

1003—6350（2015）18—2668—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0971

2015-03-14)

董 航。E-mail：donghang83@126.com