兔短陣室性心動過速心肌病模型的建立

曾向輝，周小華，孫 翔，凌 靜，卿艷云，張 翼

(1.長沙市中醫醫院(長沙市第八醫院)心內科，湖南 長沙 410100；2.湖南師范大學第一附屬醫院心內科，湖南 長沙 410005)

兔短陣室性心動過速心肌病模型的建立

曾向輝1，周小華1，孫 翔1，凌 靜1，卿艷云1，張 翼2

(1.長沙市中醫醫院(長沙市第八醫院)心內科，湖南 長沙 410100；2.湖南師范大學第一附屬醫院心內科，湖南 長沙 410005)

目的 探討建立兔短陣室性心動過速心肌病模型方法。方法15只雄性新西蘭兔。在無X線、微創、靜脈下用標測電極行短陣室速刺激右心室建立心動過速性心肌病動物模型。用10極冠狀竇電極，經改良5F橈動脈鞘，經右側前腔靜脈送至右心室，連接程序刺激儀，起搏右心室。結果起搏1周后心臟彩超檢查證實左心室舒張末內徑擴大，左心室射血分數降低，血清B型腦利鈉肽(BNP)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)升高、金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)下降。HE染色顯示心肌結構排列紊亂，細胞間質炎性浸潤。電鏡下顯示線粒體腫脹，甚至溶解、破壞，Z線模糊，閏盤結構顯示不清。3周后再復查心臟彩超、血清BNP、MMP-9、TIMP-1，心臟射血分數(EF)、短軸縮短率(FS)均大致恢復起搏前水平。結論無X線、微創靜脈下用標測電極行短陣室速刺激右心室建立心動過速性心肌病動物模型簡單可行。

心動過速性心肌?。欢剃囀倚孕膭舆^速；B型腦鈉肽；兔；模型

為了更好地進行心動過速性心肌病(Tachycardia-induced cardiomyopathy，TIC)的基礎和臨床研究，需要有簡單易行且時間較短的動物模型的制作方法。早期的心動過速性心肌病模型制作局限于大動物，需在X線下操作、開胸手術、需要呼吸機輔助通氣等，均為持續性室速的大動物模型，需植入起搏電極及脈沖發生器，不僅費用昂貴，操作復雜，而且使實驗者過多的暴露在X線下，對實驗者身體不利，造成不必要的損害，浪費大量的人力、物力、財力等資源，對實驗的進展造成極大的不利影響[1-2]。目前對短陣室速能否成功制作TIC小動物模型，尚未見相關報道。本研究首次通過無X線、非開胸靜脈下用標測電極行程序刺激右心室建立短陣室速性心肌病動物模型。

1 材料與方法

1.1 研究對象 從長沙市天勤生物技術有限公司購15只新西蘭兔，普通級，均為雄性，體重(2.5±0.2)kg，SCXK號碼(湘2009-0012)，SYXK號碼(湘2010-0013)，于湖南省人民醫院動物實驗室開展實驗。將其按隨機數字表劃分為三組，第一組：5只，損傷未起搏組；第二組：5只，起搏1周后處死；第三組：5只，起搏1周觀察2周組。各組在月齡、體重上均無統計學差異，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 術前準備 所有動物術前禁食12 h，禁飲4 h，稱重，10%的水合氯醛(湖南省兒童醫院制劑室生產)以4ml/kg腹腔內注射，5～10min后刺激角膜，角膜反射消失后在右頸部常規備皮、消毒鋪巾。相關器械、器材絡合碘浸泡消毒1 h以上。

1.2.2 手術過程 嚴格按外科無菌操作原則在右頸部做一長約3cm切口，從右側前腔靜脈植入5F自制橈動脈鞘，結扎右側前腔靜脈近端和遠端，分層縫合，絡合碘消毒，無菌敷料覆蓋。為防止動物麻醉醒后四肢抓脫敷料及橈動脈鞘：無菌敷料外加寬透明膠帶再次包扎，松緊度適宜，以防導致動物窒息死亡；用寬膠帶對后肢捆綁，放回籠中飼養。起搏各組按上述步驟植入鞘管后，用500ml配肝素注射液1.25萬U的肝素水沖鞘管預防血栓栓塞，常規青霉素80萬U肌肉注射抗感染，2次/d。

1.2.3 刺激方法 用10極冠狀竇電極(圣猶達公司)經植入橈動脈鞘送至右心室(判斷在右心室標準：心電監護上可見室性早搏；拇指和食指觸及電極隨心臟搏動；有跟頻現象)，連接程序刺激儀(蘇州工業園區東方電子儀器廠，型號：XD-5A)，將感知調至最低，電壓(3.0±0.5)V；起搏頻率為400次/min(正常時260～280次/min，因之前預實驗已完成300次/min及500次/min的頻率實驗，其中前者造模成功時間較長，不利于整個實驗時間控制；后者起搏頻率太快，死亡率高)，起搏右心室，30陣/min，每陣持續10～12個室性早搏，24 h持續約90min。每次刺激完畢將電極退出右心室，但未撤出體外，再次刺激時在清醒狀態下重新插入，避免冠狀竇電極留置心腔對血流動力學產生影響。整個刺激過程給予持續心電監護(連接心電圖機，型號為日本光電工業株式會社ECC-9130型記錄儀，用自制的針頭插入動物四肢獲得心電圖形，起搏信號后緊跟寬大畸形的QRS波群，Ⅱ、Ⅲ、aVF導聯主波向下即認為有效起搏)。每次刺激后用絡合碘消毒切口預防感染。刺激完畢后無菌敷料覆蓋，外加寬透明膠帶包扎，松緊度適宜，以防導致動物窒息死亡；用寬膠帶對后肢捆綁，放回籠中飼養。

1.3 觀察指標 分別于術前、術后1周、術后3周觀察各組動物心動過速性心肌病發病過程中不同時期的表現，有無術后感染，比較各時期的B型腦利鈉肽(BNP)水平的高低，血清中基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)的濃度變化，心臟彩色多普勒超聲中血液動力學變化及左心室的大小及射血分數的大小的變化，并進行自身對照，利用HE染色方法、電鏡分別觀察心肌纖維的排列、結構形態變化及心肌細胞超微結構的形態變化。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0分析軟件，所有數據均采用均數±標準差(±s)表示，計量資料術前、術后自身比較用成對t檢驗，各組間比較用成組t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兔心動過速性心肌病模型建立 三組動物均存活，術后均無明顯感染。在起搏4 d后均出現疲倦、乏力、食欲不振(剩下2/3食物)、反應下降(較術前同樣刺激反應遲鈍)、目光呆滯。起搏1周后所有動物出現有氣促，超聲顯示胸、腹水。但經過2周的觀察，上述癥狀消失，復查心臟彩超示胸腹水消失。

2.2 各組血清學指標比較 所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒(ELISA)。所使用同一批次試劑不需定標，使用不同批次試劑盒測定時均重新定標，見表1。

表1 不同時期的血清學指標自身比較(±s)

表1 不同時期的血清學指標自身比較(±s)

注：與術后1、2周比較，aP＜0.05；與術后2周比較，bP＜0.05；與術前比較，cP＞0.05。

項目 術前 術后1周 術后2周 術后3周BNP(pg/ml) MMP-9(ng/ml) TIMP-1(ng/ml)246.0±20.1a1.20±0.02a1.98±0.07a344.5±5.81.67±0.01b1.70±0.01b322.2±5.8 .46±0.021.25±0.03244.0±10.1c1.18±0.01c1.95±0.04c

2.3 心臟彩色多普勒超聲 分別于術前、術后1周、術后2周行心臟彩色多普勒超聲檢查。檢查前在心前區備皮，脫毛，清醒狀態，左側臥位，固定四肢。采用的心臟超聲儀為日本東芝ALOKa-10型彩色多普勒測繪二維實時超聲顯像儀，探頭發射頻率2.5 MHz。取標準胸骨旁左心室長軸切面、心尖五腔觀及標準心尖四腔觀觀察，測量左心室收縮期內徑(LviDs)、左心室舒張末內徑(LviDd)、左心室收縮末容積(ESV)、左心室舒張末容積(EDV)、短軸縮短率(FS)、E峰、A峰值等參數，連續測3個心動周期取平均值。觀察有無心包積液、瓣膜返流、胸水、腹水。操作均由湖南省人民醫院彩超室專人在同一臺儀器上完成，見表2。

表2 心臟彩色多普勒超聲不同時期自身比較(±s)

表2 心臟彩色多普勒超聲不同時期自身比較(±s)

注：與術前比較，aP＜0.05；與術后2周比較，bP＜0.05；與術前比較，cP＞0.05。

項目術后3周術前 術后1周 術后2周12.8±1.8c3.7±0.4c8.2±0.5c1.7±0.5c70.3±1.9c36.1±2.2c1.58±0.02 LviDd(mm) EDV(ml) LviDs(mm) ESV(ml) EF(%) FS(%) E/A值12.3±0.8a3.4±0.2a7.8±0.1a1.4±0.3a74.3±2.9a39.5±2.9a1.65±0.04a17.0±0.8b7.0±0.2b12.2±1.1b3.2±0.2b58.7±7.5b28.7±5.1b1.05±0.03b13.7±1.95.0±0.710.7±1.02.6±0.365.3±2.233.2±4.71.39±0.01

2.4 組織學改變(HE染色) 損傷未起搏組心肌排列規整，無炎性細胞浸潤及心肌纖維斷裂、溶解；起搏1周后停止起搏未加處理因素，心肌排列較前紊亂，有灶性炎性細胞浸潤，間質纖維少量增生；起搏1周后觀察1周心肌排列稍紊亂，可見少量心肌纖維有斷裂，有少量炎性細胞浸潤，見圖1。

2.5 電鏡觀察 損傷未起搏組右心室心尖部心肌電鏡下線粒體飽滿，界嵴明顯；Z線、M線結構清晰可見，細胞核形態正常，肌絲排列整齊有序；細胞間質正常。起搏1周后右心室心尖部心肌顯示線粒體腫脹、空泡樣變性，肌絲排列紊亂，Z、M線模糊。起搏1周觀察1周?？梢奪線、M線較清晰，線粒體體積小，可見空泡樣變性，胞漿有水腫，見圖2。

圖1 HE染色后在光學鏡下1∶100倍觀察

圖2 電鏡觀察(1∶10000)

3 討 論

3.1 起搏右心室制備心力衰竭模型的優點 心力衰竭動物模型傳統的制作方法有：(1)藥物注射法：此種方法具有代表性有阿霉素，但動物死亡率高，模型成功周期長，一般需要8～10周；(2)冠脈結扎法：該方法操作較復雜，結扎部位過高容易導致死亡，過低易導致模型失敗，且剖胸后動物死亡率高，耗時較長，費用相對偏高。目前心動過速性心肌病的動物模型制作局限在大動物，需在X線下操作、開胸手術、需要呼吸機輔助通氣。而TIC在進展為不可逆性心力衰竭之前，終止導致心動過速的病因后在一定時間內則可有心肌結構和功能部分恢復甚至全部逆轉[3]。因此及時發現和終止心動過速病因至關重要。而本實驗通過無X線、非開胸靜脈下用標測電極行程序刺激右心室建立短陣室速性心肌病動物模型周期短，避免實驗人員X線照射，且無需開胸手術及呼吸機輔助通氣，故簡便易行。

3.2 成功制作TIC動物模型 目前臨床上TIC尚無統一診斷標準，一般符合以下幾點可考慮為TIC：(1)在心動過速發生前左心室功能正常；(2)頻繁或者持續心動過速發作后左心室功能進行性損害，并排除其他致病因素；(3)心律失常或心室率控制后心室功能得到改善[4]。

本研究結果顯示術前無左心室擴大，心功能下降，經短陣室速起搏1周后出現左心室擴大、射血分數下降、胸腹水等心功能不全表現。在停止起搏1周后，血清學及心臟彩色多普勒超聲各指標均有所恢復，胸腹水消失，但較起搏前水平仍較差?？赡芘c致病因素去除時間較短，心肌細胞結構和功能的恢復有限相關；在停止起搏2周后，基本上恢復至起搏前的水平。因此，無論是從器官結構、組織形態、細胞的超微結構上，與心動過速性心肌病的特點相符，符合心動過速性心肌病的診斷標準，說明創建兔心動過速性心肌病的模型成功。既往制作TIC模型大多需要時間較長(4～6周)，但本研究短陣室速刺激1周后即可制作成功，可能與一下兩點有關：(1)動物心臟小，對外界的室速刺激耐受性低[5]；(2)在制作TIC模型時，右心室心尖部起搏，導致雙心室的矛盾運動有關[6]。相關機制還需進一步研究。

本研究通過對既往快速起搏右心室方法的改進，運用無X線、微創靜脈下用標測電極行程序刺激右心室成功建立短陣室速心肌病動物模型。不僅操作簡單，重復性好，而且可避免植入人工起搏器、實驗者暴露在X線下，大大地節省了實驗費用，對實驗的進程有很大的推動作用。為今后的心動過速性心肌病的基礎與臨床研究提供了有益的探索。

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Exploration of a method to establish rabbit models of nonsustained ventricular tachycardia cardiomyopathy.

ZENG Xiang-hui1,ZHOU Xiao-hua1,SUN Xiang1,LING Jing1,QING Yan-yun1,ZHANG Yi2.1.The Hospital of Traditional Chinese Medicine of Changsha(the Eighth Hospital of Changsha),Changsha410100,Hunan,CHINA;2. Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University,Changsha410005,Hunan,CHINA

ObjectiveTo explore a effective method to establish rabbit models of nonsustained ventricular tachycardia cardiomyopathy.MethodsFifteen New Zealand rabbits were used in this study.The right ventricle was stimulated with mapping electrode line to create nonsustained ventricular tachycardia byminimally invasive venous technique without X-ray radiation.A10 polar cap of sinus electrode was inserted through modified5F radial artery sheath and the right anterior vena cava to the right ventricle.Then the programming stimulator was connected to pace the right ventricle to create the tachycardia cardiomyopathy animal model.ResultsAfter one week of right ventricular pacing,cardiac ultrasound examination showed enlarged left ventricular end diastolic diameter,reduced left ventricular ejection fraction,increased serum B-type natriuretic peptide(BNP)and matrix metalloproteinase9(MMP-9),and decreased tissue inhibitor of metallopmteinase-1(TIMP-1).HE staining showed myocardial structural derangement andinterstitial inflammatory cell infiltration.Electron microscopy revealed mitochondrial swelling,dissolution,or even lysis and destruction,fuzzy Z line and unclear intercalated discs.Three weeks later,the heart color,serum BNP,MMP-9, TIMP-1,ejection fraction(EF),fraction shortening(FS)in the rabbits recovered to former levels.ConclusionIt is a simple and practical method to establish animal models of tachycardiomyopathy by stimulating animal’s right ventricle with mapping electrode line to create nonsustained ventricular tachycardia underminimally invasive,venous technique without X-ray radiation.

Tachycardiomyopathy;Nonsustained ventricular tachycardia;B-type natriuretic peptide(BNP); Rabbit;Model

R-332

A

1003—6350（2015）16—2347—04

2015-02-08)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0848

張 翼。E-mail：345665560@qq.com