肺腺癌組織中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin的表達及意義

肖高芳，丁 宇，高雙全，杜日昌，李 靜，黃 偉，王林輝，徐 彤

(韶關市粵北人民醫(yī)院病理科，廣東 韶關 512026)

肺腺癌組織中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin的表達及意義

肖高芳，丁 宇，高雙全，杜日昌，李 靜，黃 偉，王林輝，徐 彤

(韶關市粵北人民醫(yī)院病理科，廣東 韶關 512026)

目的 探討Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白在肺腺癌組織中的表達及三者之間的關系。方法采用免疫組化S-P法檢測72例肺腺癌組織中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達情況，并結合臨床病理資料分析Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin表達的相關性。結果(1)肺腺癌組織中Cripto-1、ZEB-l和E-cadherin的表達率分別為54.17%、58.33%、36.11%，癌旁肺組織分別為20.00%、22.50%、92.50%，三種蛋白在肺腺癌組織和癌旁肺組織中的表達差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。(2)肺腺癌組織中Cripto-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達與肺腺癌腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結轉移有相關性(P＜0.05)。(3)肺腺癌組織中Cripto-1的表達與ZEB-1的表達呈正相關(P＜0.05)，Cripto-1、ZEB-1的表達與E-cadherin的表達呈負相關(P＜0.05)。結論Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌發(fā)展、浸潤和轉移中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測三者能更好地評估肺腺癌患者的預后。

肺腺癌；Cripto-1；ZEB-1；E-cadherin；免疫組織化學

肺癌是當今世界范圍內腫瘤死亡的首要原因，遠處轉移和腫瘤生成是腫瘤進展和致死的兩個最主要的決定因素。我國是世界上肺癌患者最多的國家，近年來肺癌發(fā)病率和病死率一直呈上升趨勢，為此，必須尋找更加精確、有效的分子標志物，以期早期發(fā)現腫瘤，為肺癌的預后判斷以及靶向治療等提供科學資料。

人Cripto-1(CR-1)又稱畸胎癌衍生生長因子-1 (Teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)，它被認為是一個癌胚基因，主要表達于胚胎早期發(fā)育階段，當細胞發(fā)生轉化或惡變時又重新表達。研究表明CR-1過表達于人類多種惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌等)中，且其表達水平與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移有關。腫瘤上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一個多步驟的過程，指腫瘤細胞喪失上皮細胞的特性，獲得運動和侵襲能力。ZEB-1(Zinc finger E-box-binding protein1)是一種鋅指結合蛋白，有學者研究發(fā)現ZEB-1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，并且ZEB-1參與了EMT的調節(jié)過程。本研究通過檢測肺腺癌組織中CR-1的表達情況，同時聯(lián)合檢測EMT相關因子ZEB-1和E-cadherin的表達，探討CR-1在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展及其轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集韶關市粵北人民醫(yī)院2010年8月至2014年8月肺腺癌手術切除標本72例作為觀察組，其中男性40例，女性32例，年齡38～78歲，中位年齡55歲；其中高～中分化44例，低分化28例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期27例；組織學分型：腺泡型20例，實體型18例，乳頭型25例，其他9例；有淋巴結轉移者43例，無淋巴結轉移者29例。隨機選擇40例癌旁肺組織作為對照組。所有患者術前均未接受放化療和免疫治療等治療，且臨床資料齊全。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人單克隆抗體CR-1、ZEB-1購自Santa Cruz公司，即用型兔抗人單克隆抗體E-cadherin、免疫組化S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 方法 所有標本均用10%中性緩沖福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋，切片機4 μm連續(xù)切片，分別用于免疫組化及常規(guī)HE染色。應用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P法)檢測肺腺癌組織中CR-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達水平。

1.4 結果判定標準 免疫組化判定標準：(1) CR-1蛋白：定位于腫瘤細胞質，呈棕黃色顆粒狀，判定時需綜合考慮陽性細胞染色強度和比例。陽性強度：無著色0分,淺著色1分，中等著色2分，強著色3分。陽性細胞所占比例分為：＜l%0分，1%～3%1分，3%～67%2分，＞67%3分，陽性強度和陽性細胞所占比例得分相加為最后得分：0分為陰性，l～2分為(+)，3～4 (++)，5～9分為(+++)；(2)ZEB-1陽性結果判定：定位于腫瘤細胞核內，彌漫染色，按著色度計分：無著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕褐色3分；≥1分計為陽性，＜1分計為陰性。(3)E-cadherin：定位于腫瘤細胞膜，無著色0分，1%～25%l分，26%～75%2分，＞75%3分；0～1分為陰性，2～3分為陽性。免疫組化結果判讀采用雙盲法，由三位病理醫(yī)生獨立觀察后取平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗結果應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，免疫組化結果和臨床病理資料之間采用χ2檢驗，應用Spearman非參數相關分析CR-1、ZEB-1和E-cadherin表達的相關性，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化染色檢測 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌及正常肺組織中的表達 肺腺癌組織中CR-l主要在細胞質表達(圖1A)，腫瘤組織CR-1陽性率(54.17%)高于癌旁肺組織(20.0%)，ZEB-l主要在腫瘤細胞核表達(圖1B)，腫瘤組織ZEB-1陽性率(58.33%)高于癌旁肺組織(22.5%)，E-cadherin主要在細胞膜表達(圖1C)，腫瘤組織E-cadherin陽性率(36.11%)低于癌旁肺組織(92.5%)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

圖1 肺腺癌組織中CR-1、ZEB-1和E-cadherin的表達

表1 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌及正常肺組織中的表達[例（%）]

2.2 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌中的表達與患者臨床病理特征的關系 肺腺癌組織中CR-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表達與肺腺癌腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結轉移密切相關，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，肺腺癌組織中三者的表達與患者性別、年齡和腫瘤組織學類型無關(P＞0.05)，見表2。

表2 CR-1的表達及其與肺腺癌臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 肺腺癌中CR-1、ZEB-1和E-cadherin的相關性分析 Spearman相關分析結果顯示，肺腺癌組織中CR-1的表達與ZEB-1呈正相關(r=0.279，P＜0.05)，CR-1的表達與E-cadherin呈負相關(r=-0.237，P＜0.05)，ZEB-1的表達與E-cadherin亦呈負相關(r=-0.244，P＜0.05)，見表3。

表3 肺腺癌中CR-1與ZEB-1、E-cadherin的相關性分析(例)

3 討論

CR-1蛋白最開始是從人類胚胎癌細胞中分離提取出來，因其含有修飾的EGF樣結構域被歸類于EGF相關肽家族中，它是一種由糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的膜蛋白質，是轉化生長因子TGF-β蛋白亞家族成員Nodal、GDF-1和GDF-3配體的共同受體，在早期胚胎發(fā)育和細胞轉化過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現CR-1在腫瘤生長過程中通過影響細胞的增殖、存活、腫瘤細胞遷移侵襲、上皮-間質轉化(EMT)和血管形成等發(fā)揮致瘤基因的作用[2-7]。CR-1在早期胚胎發(fā)育時期表達，成年人體組織中CR不表達或僅有低水平表達[8-13]，然而在大多數惡性腫瘤，如乳腺癌、結直腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌和宮頸癌等，CR-1卻異常高表達[6，13]，因此CR-1被認為是腫瘤免疫治療的一個潛在的特異性靶點。應用轉基因動物模型研究發(fā)現CR-1通過下調細胞表面粘連蛋白(E-cadherin等)、上調間質標記物(比如Vimentin、N-cadherin和Snail)的表達，即發(fā)生EMT從而促進乳腺腫瘤的發(fā)生。此外，有文獻報道CR-1能富集胚胎、黑色素瘤、前列腺和胰腺等腫瘤細胞中具有干細胞特性的細胞，它可能參與了EMT介導的已分化的腫瘤細胞向腫瘤干細胞重編程的過程。

ZEB-1的編碼基因位于人類10號染色體短臂，主要結構特點是C端和N端都有C2H2鋅指結構簇和位于中間的一個同源結構域，它是Snail超家族(包括Snail、Slug、ZEB-1、ZEB-2等)中的一員。有學者發(fā)現在乳腺癌、骨肉瘤、胃癌中，ZEB-1作為一種轉錄抑制因子，ZEB-1可能通過增強腫瘤細胞的遷移能力，在腫瘤細胞的EMT過程中起重要作用[14-17]。近年來研究證實，ZEB-1與其他誘導EMT的轉錄因子(比如Twist、Snail、Slug和SIP)一樣，通過與E-cadherin編碼基因CDH1的E-box(CACCTG)序列結合，使其轉錄下調，促進EMT的發(fā)生，從而增強腫瘤細胞侵襲和轉移能力[18]。有研究發(fā)現ZEB-1在子宮內膜癌、結腸癌和前列腺癌中均異常表達，且與腫瘤的進展、腫瘤細胞分化程度低下、腫瘤的遠處轉移和預后不良相關[19-21]。還有學者研究發(fā)現肝細胞性肝癌組織中ZEB-1陽性表達，而E-cadherin表達缺失，且與肝癌患者不良預后有關，得出的結論是ZEB-1陽性表達誘導EMT發(fā)生以致腫瘤組織惡性程度高[22]。

EMT在腫瘤進展、轉移和腫瘤細胞耐藥性方面發(fā)揮重要作用，發(fā)生EMT的標志是細胞表面連接蛋白E-cadherin和緊密結合蛋白Occludins和Claudins表達下調，代之以Vimentin、Fibronectin和/或N-cadherin表達上調，導致細胞連接不穩(wěn)定，使細胞獲得運動特性。E-cadherin是鈣粘蛋白家族中的一個重要成員，廣泛分布于各類上皮細胞表面，具有促進上皮細胞間相互粘附，維持上皮組織完整性和上皮細胞極性的功能，其表達下調促進EMT的發(fā)生，從而導致腫瘤惡性進展和不良預后。

本研究結果顯示，肺腺癌組織中CR-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白表達與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結轉移均顯著相關，高～中分化腫瘤組織中CR-l和ZEB-1的表達明顯高于低分化腫瘤組織，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期CR-l和ZEB-1的表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結轉移者CR-l和ZEB-1的表達明顯高于無淋巴結轉移者；高～中分化腫瘤組織中E-cadherin的表達明顯低于低分化腫瘤組織，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期E-cadherin的表達明顯低于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結轉移者E-cadherin的表達明顯低于無淋巴結轉移者，表明CR-1、ZEB-1和E-cadherin可能在肺腺癌的浸潤和轉移過程中起重要作用。此外，CR-1的表達與ZEB-1的表達呈正相關，CR-1和ZEB-1的表達與E-cadherin的表達呈負相關，提示CR-1和ZEB-1可能通過抑制E-cadherin蛋白的表達，使腫瘤細胞間的連接作用減弱，從而降低腫瘤細胞間的粘附力，導致腫瘤細胞失去上皮細胞極性，運動性增強，即腫瘤細胞發(fā)生EMT，使腫瘤細胞更容易浸潤和轉移。

綜上所述，CR-1和ZEB-1的上調同時E-cadherin的下調可能在促進腫瘤侵襲轉移等方面發(fā)揮協(xié)同作用，與腫瘤的預后判斷有關。CR-1、ZEB-1和E-cadherin三者的聯(lián)合檢測將可能有利于臨床上預測肺腺癌患者的預后并為肺腺癌的基因治療提供新的方法和策略，但有關的作用機制還有待進一步研究。

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Expression and significance of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin in lung adenocarcinoma tissues.

XIAO Gao-fang,DING Yu,GAO Shuang-quan,DU Ri-chang,LI Jing,HUANG Wei,WANG Lin-hui,XU Tong.Department of Pathology,Yuebei People's Hospital,Shaoguan512026,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression levels of Cripto-l,ZEB-1 and E-cadherin proteins in lung adenocarcinoma tissues,and to explore the correlation between these three proteins.MethodsThe expressions of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin proteins were examined by immunohistochemistry in72 samples of lung adenocarcinoma tissues.And the correlation between Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin expression was also analyzed by clinical and pathological data.ResultsThe positive expression rate of Cripto-l,ZEB-1 and E-cadherin were54.17%,58.33%,36.11%respectively in lung adenocarcinoma tissues,and20.0%,22.5%,92.5%respectively in adjacent tissues,with statistically significant differences between two groups(P＜0.01).The expression of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin showed significant correlation with the differentiation,clinical stage and lymph node metastasis(P＜0.05). The expression of Cripto-1 showed a positive correlation with ZEB-1(P＜0.05),while the expression of Cripto-1 and ZEB-1 showed a negative correlation with E-cadherin in the lung adenocarcinoma tissues(P＜0.05).ConclusionExpressions of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin may be involved in the progression,invasion and metastasis of lung adenocarcinoma.Acombined examination of these three proteins may help evaluate the prognosis of lung adenocarcinoma.

Lung adenocarcinoma;Cripto-1;ZEB-1;E-cadherin;Immunohistochemistry

R734.2

A

1003—6350（2015）16—2351—04

2015-03-01)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0849

韶關市醫(yī)學科研基金立項(編號：Y14013)

高雙全。E-mail：gsq76@tom.com