電針內關穴對大鼠體外循環后心肌細胞超微結構和線粒體通透性轉運孔的影響

涂 杰，梁東科，劉國鋒，劉菊梅，梁蓓薇，韋秋英，張炳東

(廣西醫科大學第一附屬醫院心血管病研究所手術麻醉室，廣西 南寧 530021)

電針內關穴對大鼠體外循環后心肌細胞超微結構和線粒體通透性轉運孔的影響

涂 杰，梁東科，劉國鋒，劉菊梅，梁蓓薇，韋秋英，張炳東

(廣西醫科大學第一附屬醫院心血管病研究所手術麻醉室，廣西 南寧 530021)

目的 探討電針(EA)內關穴對大鼠體外循環(CPB)后心肌細胞超微結構和線粒體通透性轉運孔(MPTP)的影響。方法成年雄性SD大鼠75只，隨機分為五組(n=15)：假手術組(S組)、CPB組、CPB+EA組、CPB+蒼術苷組(CPB+Atr組)和CPB+EA+蒼術苷組(CPB+EA+Atr組)。采用尾動脈插管灌注，右頸靜脈插管引流建立CPB模型。S組僅行麻醉和動靜脈插管；CPB組行CPB 2 h；CPB+EA組行CPB 2 h且在CPB期間使用電針刺激雙側內關穴；CPB+Atr組在CPB開始時靜脈注射蒼術苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB組；CPB+EA+Atr組在CPB開始時靜脈注射蒼術苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB+EA組。麻醉復蘇后2 h，取右股動脈血測定心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性；取左心室心肌組織，電鏡觀察心肌細胞超微結構，行線粒體損傷評分，并用差速離心法分離線粒體，測定線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性。結果與S組比較，其余各組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高，心肌細胞超微結構損傷較重，線粒體損傷評分增加，線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)；與CPB組比較，CPB+EA組和CPB+EA+Atr組cTnI濃度和CK-MB活性降低，心肌細胞超微結構損傷較輕，線粒體損傷評分下降，線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性降低(P＜0.05)。蒼術苷可抑制電針內關穴對心肌的保護作用(P＜0.05)。結論電針內關穴可減輕大鼠體外循環后心肌細胞超微結構損傷，其機制可能與抑制線粒體內鈣超載和減少MPTP的開放有關。

電針；內關穴；體外循環；線粒體損傷；線粒體通透性轉換孔

體外循環(Cardiopulmonary bypass,CPB)過程中手術操作引起的直接損傷、循環管路與血液接觸激活的全身炎癥反應以及心臟停跳復跳所致的缺血再灌注損傷等因素，均可導致術后發生不同程度的心肌損傷[1]。內關穴屬手厥陰心包經，素有“內關主刺氣快攻，兼炙心胸肋痛疼”的古訓，大量基礎和臨床研究[2-4]證實電針(Electroacupuncture，EA)內關穴具有明顯的心肌保護作用，但其具體機制仍不清楚。本研究擬觀察電針內關穴對大鼠體外循環后心肌細胞超微結構和線粒體通透性轉運孔的影響，并初步探討其發揮心肌保護作用的機理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 多功能監測儀(日本光電公司)，動物膜式氧合器(東莞科威醫療器械有限公司)，雙頭滾壓泵(德國Stockert公司)，多用電子穴位治療儀(上海華誼儀器公司)，透射電鏡(日本JEOL公司)，紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，線粒體提取試劑盒(南京建成生物工程研究所)，二氨基聯苯胺蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，蒼術苷(Sigma公司，美國)，Ca2+濃度試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物與分組 本動物實驗經廣西醫科大學動物委員會批準，并符合國家科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。清潔級健康雄性SD大鼠75只，4～6個月齡，體重320～420 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法，將75只大鼠隨機分為五組：假手術組(S組)、CPB組、CPB+ EA組、CPB+蒼術苷組(CPB+Atr組)和CPB+EA+蒼術苷組(CPB+EA+Atr組)，每組15只。S組僅于麻醉誘導后行機械通氣和各部位插管，不行CPB；CPB組行CPB 2 h；CPB+EA組行CPB 2 h，且在CPB期間使用電針刺激雙側內關穴；CPB+Atr組在CPB開始時靜脈注射蒼術苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB組；CPB+ EA+Atr組在CPB開始時靜脈注射蒼術苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB+EA組。

1.3 CPB模型制備 參照文獻[5]制作大鼠體外循環模型。腹腔注射10%烏拉坦10 ml/kg麻醉，16 G靜脈導管行氣管插管后機械通氣，潮氣量3 ml/kg，呼吸頻率60次/min。經右頸總動脈插入雙腔球囊擴張導管(球囊直徑3.5 mm)至大鼠升主動脈根部，以備主動脈阻斷和心肌停跳液灌注。采用尾動脈插管灌注，右頸靜脈插管引流建立CPB。無血預充，灌注流量約為每分鐘100 ml/kg。CPB開始后即逐漸降溫，15 min后大鼠鼻溫接近32℃，充氣升主動脈內雙腔球囊擴張導管套囊，阻斷升主動脈，并灌注St.ThomasⅡ型心肌停跳液15 ml/kg，使心臟停跳。在心臟停跳15 min后逐漸復溫，并于心臟停跳30 min時套囊放氣，開放升主動脈，恢復心臟供血，以使心臟復跳。CPB轉流2 h后逐漸減少灌注流量，在心率血壓穩定的情況下結束體外循環。待自主呼吸恢復平穩后停止機械通氣，拔除氣管導管，并密切觀察大鼠麻醉復蘇后生命體征，2 h后頸椎脫臼處死大鼠。

1.4 電針方法 內關穴定位參考文獻[2]，位于尺橈骨縫間，距腕關節約3 mm處。在CPB開始后，取大鼠雙側內關穴，用0.3 mm×15 mm毫針刺入皮下2 mm，接電針儀，疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，強度1 mA，CPB結束時拔針。

1.5 血漿心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性的檢測 麻醉復蘇后2 h，從大鼠右股動脈插管處取血，離心，取上清液，用全自動生化分析儀檢測cTnI濃度和CK-MB活性。

1.6 電鏡觀察心肌細胞超微結構和心肌線粒體損傷評分 麻醉復蘇后2 h，將大鼠頸椎脫臼處死，剖胸取左心室心肌組織，固定包埋切片后，于透射電鏡下觀察心肌細胞超微結構，并行心肌線粒體損傷評分，評分方法參考文獻[6]。

1.7 線粒體內Ca2+濃度檢測 用差速離心法提取心肌線粒體后，將線粒體用20倍的預冷勻漿溶液制成混懸液，按照Ca2+試劑盒的使用說明，用比色法測定Ca2+濃度。

1.8 線粒體通透性轉運孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)活性測定 參照Jie等[7]的方法，用紫外分光光度計連續測定線粒體混懸液在540 nm處的吸光值，每30 s測定1次，持續6 min。以第1次測定值為參照值，其余時點的測定值與之相比，所得比值即為相對吸光度值(A540)，用最大A540值與最小A540值的差值表示MPTP活性，從而反映其開放水平。

1.9 統計學方法 采用SPSS15.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 S組大鼠全部順利完成試驗；CPB組有2只大鼠因CPB后心功能衰竭死亡；CPB+ EA組有1只大鼠因CPB后心律失常死亡;CPB+Atr組有1只大鼠因心臟復跳失敗死亡；CPB+EA+Atr組有1只大鼠因CPB后心功能衰竭死亡，1只大鼠因心臟復跳失敗死亡。

2.2 各組大鼠血漿cTnI濃度和CK-MB活性的比較 與S組比較，其余各組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高(P＜0.05)；與CPB組比較，CPB+EA組和CPB+EA+Atr組cTnI濃度和CK-MB活性下降(P＜0.05)，CPB+Atr組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高(P＜0.05)；與CPB+EA組比較，CPB+EA+Atr組 cTnI濃度和CK-MB活性升高(P＜0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠心肌組織超微結構的觀察 S組心肌纖維排列規整，各帶明顯，各細胞器未見異常；CPB組心肌纖維排列紊亂，肌節結構不清，線粒體腫脹，內有空泡形成，嵴斷裂；CPB+EA組心肌纖維排列略紊亂，線粒體輕微腫脹，少量嵴斷裂。CPB+Atr組心肌纖維排列明顯紊亂，線粒體明顯腫脹，內有大量空泡形成，嵴丟失；CPB+EA+Atr組心肌纖維排列紊亂，線粒體略水腫，峭斷裂，見圖1。

2.4 各組大鼠線粒體損傷評分、線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性的比較 與S組比較，其余各組線粒體損傷評分增加，線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)；與CPB組比較，CPB+EA組和CPB+EA+ Atr組線粒體損傷評分下降，線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性降低(P＜0.05)，CPB+Atr組線粒體損傷評分增加，線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)；與CPB+EA組比較，CPB+EA+Atr組線粒體損傷評分增加，線粒體內Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠cTnI、CK-MB、線粒體損傷評分、Ca2+濃度和MPTP活性的比較(±s)

表1 各組大鼠cTnI、CK-MB、線粒體損傷評分、Ca2+濃度和MPTP活性的比較(±s)

注：與S組比較，aP＜0.05；與CPB組比較，bP＜0.05;與CPB+EA組比較，cP＜0.05。

S組CPB組CPB+EA組CPB+Atr組CPB+EA+Atr組F值P值0.042±0.009 0.092±0.026a0.050±0.013ab0.097±0.022ab0.062±0.017abc4.231 0.000 20 18 19 19 18 0.02±0.01 4.73±0.67a1.58±0.26ab4.86±0.73ab2.85±0.33abc17.661 0.000 11.7±2.4 57.3±13.7a32.7±11.3ab62.6±14.2ab43.8±12.5abc28.125 0.000 0.73±0.20 2.88±0.85a1.46±0.53ab3.17±0.86ab1.82±0.64abc8.424 0.000 0.51±0.08 4.84±1.26a2.68±1.13ab5.33±1.47ab3.47±1.06abc12.253 0.000

圖1 各組大鼠心肌組織超微結構的觀察(醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，×20 000)

3 討 論

本研究采用尾動脈插管灌注，右頸靜脈插管引流的方法建立大鼠CPB模型，實現了接近生理的全流量灌注，同時經右頸總動脈插入雙腔球囊擴張導管至升主動脈根部，充氣阻斷主動脈，灌注心肌停跳液使心臟停跳，從而在最大程度上模擬了CPB造成的心肌缺血再灌注損傷，為研究心臟手術中心肌損傷提供了可靠的動物模型。大量基礎和臨床研究[2-4]證實電針內關穴對心肌缺血再灌注損傷有一定的保護作用，因此本研究選用內關穴作為刺激穴位，內關穴的定位和刺激方法參照文獻[2]。蒼術苷是MPTP特異性開放劑，本研究參照預試驗結果和文獻[8]，選擇在CPB開始時靜脈注射蒼術苷5 mg/kg。

心肌細胞超微結構的變化可直接反映心肌細胞損傷的程度[9]。當心肌發生缺血缺氧性損傷時，其亞細胞結構可發生改變，以線粒體的改變最為顯著，表現為線粒體水腫、峭斷裂和空泡化等，Dadabayev等[10]認為維持線粒體結構的完整性，是心肌細胞能量代謝順利進行的最基本條件。本研究發現，與S組比較，CPB組和CPB+EA組心肌細胞超微結構出現不同程度的損傷，但CPB+EA組心肌線粒體損傷評分均明顯低于CPB組，從形態學上證實了電針內關穴可保持心肌線粒體膜和空間結構的完整性，有利于減輕CPB后心肌細胞的損傷。

cTnI和CK-MB是評價心肌細胞損傷程度的常用指標，有較高的特異性和敏感性[11]。本研究結果表明，與S組比較，CPB組和CPB+EA組cTnI濃度和CK-MB活性明顯升高，說明CBP可造成一定程度的心肌細胞損傷，其機制可能與體外循環管路和血液接觸激活的全身炎性反應、心臟停跳復跳所致的心肌缺血再灌注損傷等因素有關；而CPB+EA組cTnI濃度和CK-MB活性明顯低于CPB組，從分子生物學上證實了電針內關穴對大鼠CBP后的心肌保護作用是明顯的。

線粒體不僅是細胞的能量代謝中心，同時也是細胞Ca2+的緩沖器，具有攝取和釋放Ca2+的能力，對維持胞漿內Ca2+的穩態起重要作用[10]。CPB所致的全身炎性反應、氧化應激反應和缺血再灌注損傷等傷害性因素，可引起細胞膜上的Ca2+通道蛋白變構，使細胞外Ca2+內流增加，導致胞漿內鈣超載；胞漿內高濃度的Ca2+使線粒體攝取Ca2+增加，導致線粒體內形成磷酸鈣沉積，引起氧化磷酸化過程障礙，細胞能量代謝發生障礙，導致細胞損傷發生[12]。本研究結果顯示，與S組比較，CPB組和CPB+EA組線粒體內Ca2+濃度明顯升高，說明大鼠CPB后線粒體內發生了鈣超載，這與Drabek等[13]研究一致。而CPB+EA組線粒體內Ca2+濃度明顯低于CPB組，提示電針內關穴的心肌保護作用可能與抑制線粒體內鈣超載有關。

近年有研究表明線粒體凋亡是CPB后心肌細胞損傷的最主要形式，而線粒體凋亡通路的分子基礎是MPTP的開放[12]。MPTP是位于線粒體膜上的多蛋白復合體，在維持線粒體膜電位、保護線粒體結構和功能方面具有重要作用[14]。生理狀態下，MPTP關閉，當受到傷害性因素刺激時(如缺血缺氧、氧化應激等)，MPTP異常開放，大量水和無機離子進入線粒體，導致線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡化，同時細胞色素C通過MPTP釋放到胞漿中，激活一系列凋亡蛋白酶，導致細胞凋亡[14]。因此，大量研究已將抑制MPTP的開放作為心肌保護中的新策略。本研究發現，CPB+EA組心肌細胞MPTP的開放程度明顯低于CPB組，但是，與CPB+EA組比較，CPB+EA+Atr組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高，心肌線粒體損傷評分增加，表明給予MPTP特異性開放劑蒼術苷后，電針內關穴的心肌保護作用被拮抗，因而，我們推測電針內關穴的心肌保護作用還可能與減少MPTP的開放程度有關。

綜上所述，電針內關穴可減輕大鼠體外循環后心肌細胞超微結構損傷，其機制可能與抑制線粒體內鈣超載和減少MPTP的開放有關，其臨床應用前景可觀。

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Effect of electroacupuncture at Neiguan point on myocardial ultrastructure and mitochondrial permeability transition pore in rats undergoing cardiopulmonary bypass.

TU Jie,LIANG Dong-ke,LIU Guo-feng,LIU Ju-mei, LIANG Bei-wei,WEI Qiu-ying,ZHANG Bing-dong.Operation&Anesthesia Room,Institute of Cardiovascular Disease, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture at Neiguan point(EA)on myocardial ultrastructure and mitochondrial permeability transition pore(MPTP)in rats undergoing cardiopulmonary bypass (CPB).MethodsSeventy-five adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups(n=15 each): sham operation group(group S),group CPB,group CPB+EA,CPB+infuse atractyloside group(group CPB+Atr),and CPB+EA+infuse atractyloside group(group CPB+EA+Atr).Tail arteries and right jugular vein were cannulated for CPB.Rats in group S were anaesthetized and cannulated;rats in group CPB were subjected to CPB for 2 h;rats in group CPB+EA were subjected to CPB for 2 h and electro-acupunctured at Neiguan point during CPB;rats in group CPB+Atr and group CPB+EA+Atr were infused atractyloside 5 mg/kg at the beginning of CPB.Blood samples were taken from right femoral artery at 2 h after anesthesia resuscitation for determination of plasma cardiac troponin I(cT-nI)concentration and creatine kinase-MB(CK-MB)activity,and those animals were sacrificed to obtain the myocardial specimens from left ventricle.Electron microscope was used to observe the changes of mitochondrial ultrastructure, and the severity of mitochondria injury was scored.Mitochondria fractions were isolated by differential centrifugation to test the concentration of Ca2+and MPTP opening degree.ResultsCompared with group S,the plasma concentrations of cTnI and activity of CK-MB were significantly higher,the damage of myocardial ultrastructure was aggravated,the score of mitochondrial injury,the concentration of Ca2+in mitochondrial and MPTP opening degree were significantly increased in other four groups(P＜0.05).Compared with group CPB,the plasma concentrations of cTnI and activity of CK-MB were significantly lower,the damage of myocardial ultrastructure was attenuated,the score of mitochondrial injury,the concentration of Ca2+in mitochondrial and MPTP opening degree were significantly decreased ingroup CPB+EA and group CPB+EA+Atr(P＜0.05).However,the protective effects of EA were inhibited by atractyloside(P＜0.05).ConclusionElectroacupuncture at Neiguan point can reduce the damage of myocardial ultrastructure in rats undergoing CPB.The mechanism is closely related to inhibiting calcium overload in mitochondrial and decreasing MPTP opening.

Electroacupuncture;Neiguan;Cardiopulmonary bypass(CPB);Mitochondrial damage;Mitochondrial permeability transition pore(MPTP)

R-332

A

1003—6350（2015）10—1405—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0504

2014-12-01)

廣西壯族自治區自然科學基金(編號：2013GXNSFBA019124)

張炳東。E-mail：zbdong2007@163.com