絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合灌注對膀胱癌患者血清及沖洗液中粘附分子、蛋白酶表達的影響

楊 渝，朱曉應，郭嘉祥

(中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院泌尿外科，北京 100048)

絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合灌注對膀胱癌患者血清及沖洗液中粘附分子、蛋白酶表達的影響

楊 渝，朱曉應，郭嘉祥

(中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院泌尿外科，北京 100048)

目的 分析絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合灌注對膀胱癌患者血清及沖洗液中粘附分子、蛋白酶表達的影響。方法選取2012年10月至2014年10月間在本院接受經尿道膀胱腫瘤電切術(TURBT)治療的非肌性浸潤性膀胱癌患者86例，其中接受絲裂霉素、吡柔比星膀胱灌注治療者(對照組)和接受絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合灌注治療者(觀察組)各43例。檢測兩組患者治療后的血清及沖洗液中的粘附分子、蛋白酶表達情況。結果(1)血清粘附分子：觀察組血清細胞粘附分子(CD44v6)、E-鈣黏素(E-cadherin)、肝細胞粘附分子(hepaCAM)水平高于對照組，上皮特異性粘附分子(EpCAM)、可溶性細胞間粘附分子-1(sICAM-1)、可溶性血管黏附分子-1(sVCAM-1)水平低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；(2)沖洗液粘附分子：觀察組沖洗液CD44v6、E-cadherin、hepaCAM水平高于對照組，EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1水平低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；(3)蛋白酶：觀察組血清及沖洗液中基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)水平低于對照組，半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)水平高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合灌注可以調節膀胱癌患者的粘附分子及蛋白酶表達，抑制侵襲轉移能力、促進腫瘤細胞凋亡。

膀胱癌；免疫調節劑；粘附分子；蛋白酶

膀胱癌是泌尿系統最為常見的惡性腫瘤之一，其中70%以上患者的腫瘤類型為淺表性，即非肌層浸潤型，多采用手術治療。經尿道膀胱腫瘤電切術(TURBT)是治療非肌層浸潤型膀胱癌的首選方案，但是術后復發率高達60%以上。手術治療后的膀胱癌患者多輔以化療，最常見的為術后膀胱內灌注化療藥物，可以達到一定治療效果但是會削弱患者免疫功能，導致腫瘤復發[1]。在膀胱化療藥物灌洗同時序貫加入免疫調節劑是在抑制腫瘤細胞活性同時提升患者免疫功能的最新方案，相關研究已經發現化療藥物與免疫調節劑的序貫膀胱內灌洗可以優化膀胱癌患者的治療效果，但是具體機制未明[2]。本次研究主要分析絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合灌注對膀胱癌患者血清及沖洗液中粘附分子、蛋白酶家族含量的影響，具體報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年10月至2014年10月間在本院接受經尿道膀胱腫瘤電切術(TURBT術)治療的非肌性浸潤性膀胱癌患者86例作為研究對象，所有患者具有典型的尿頻、尿急、尿痛等臨床癥狀，且經膀胱鏡及CT檢查確診。納入標準：(1)首發的單發性腫瘤患者；(2)臨床分期Ta、T1期，病理分級G1、G2級；(3)原發性膀胱癌未見遠處轉移；(4)不伴有其他腫瘤或者無法控制的嚴重泌尿系統感染；(5)患者及家屬在了解研究過程后自愿簽署知情同意書。按照隨機數表法將所有入組患者分為兩組各43例，對照組采用術后絲裂霉素、吡柔比星聯合膀胱內灌注化療，觀察組采用術后絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合灌注化療。觀察組患者中男性23例，女性20例，年齡43～76歲，平均(58.27±7.93)歲，臨床分期中Ta期28例，T1期15例，病理分級中G1級30例，G2級13例；對照組患者中男性22例，女性21例，年齡45～78歲，平均(57.78±7.63)歲，臨床分期中Ta期26例，T1期17例，病理分級中G1級29例，G2級14例。兩組患者的基線資料比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 灌注方法 觀察組患者接受絲裂霉素、吡柔比星和免疫調節劑聯合膀胱內灌注化療，具體如下：患者術后14 d或者尿液清澈后7 d進行膀胱內灌注化療，灌注前3 h限制飲水，灌注實施前囑患者排空尿液。將已經消毒的導尿管置入膀胱內，將40 mg的絲裂霉素(MMC)融入50 ml生理鹽水中注入膀胱，一周后將80 mg的卡介苗(BCG)融入生理鹽水中注入膀胱。化療藥物灌注入膀胱內每隔10 min更換一次體位，包括左側、右側、仰臥位，化療藥物在膀胱內保留2 h后排出。每周實施一次化療，以4次為一個療程，共灌注化療兩個療程以上。對照組患者接受術后絲裂霉素、吡柔比星聯合膀胱內灌注化療，具體方法及療程同觀察組。

1.2.2 血清及沖洗液采集方法 灌洗療程結束后當天，采集患者外周靜脈血5 ml，離心機中以3 000 r/min的速度離心取上清，保存于-80℃中備用。沖洗液的留取同樣在療程結束后，將灌洗液排出并沖洗膀胱，留取沖洗液保存于-80攝氏度中備用。

1.2.3 指標檢測方法 采用酶聯免疫吸附法測定細胞粘附分子(CD44v6)、上皮特異性粘附分子(EpCAM)、E-鈣黏素(E-cadherin)、肝細胞粘附分子(hepaCAM)、可溶性細胞間粘附分子-1(sICAM-1)、可溶性血管粘附分子-1(sVCAM-1)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0軟件錄入和分析數據，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗、計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清粘附分子水平 觀察組患者治療后的血清CD44v6、E-cadherin、hepaCAM水平高于對照組，EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1水平低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組患者接受不同治療方案后的血清黏附分子水平比較(±s，ng/L)

表1 兩組患者接受不同治療方案后的血清黏附分子水平比較(±s，ng/L)

組別觀察組對照組t值P值CD44v6 76.28±11.05 40.61±7.23 6.493＜0.05 EpCAM 37.16±5.25 59.83±7.11 5.883＜0.05 E-cadherin 70.52±7.79 35.55±5.20 8.263＜0.05 hepaCAM 88.26±9.27 51.27±6.33 6.093＜0.05 sICAM-1 35.51±4.56 68.54±7.84 7.274＜0.05 sVCAM-1 60.56±7.78 104.82±14.28 8.273＜0.05

2.2 沖洗液粘附分子水平 觀察組患者治療后的沖洗液CD44v6、E-cadherin、hepaCAM水平高于對照組，EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1水平低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 蛋白酶水平 觀察組患者治療后的血清及沖洗液中MMP-2、MMP-9水平均低于對照組，Caspase-8水平高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 兩組患者接受不同治療方案后的沖洗液黏附分子水平比較(±s，ng/L)

表2 兩組患者接受不同治療方案后的沖洗液黏附分子水平比較(±s，ng/L)

組別觀察組對照組t值P值CD44v6 67.21±11.05 32.53±7.23 6.395＜0.05 EpCAM 31.37±5.16 52.76±7.05 6.621＜0.05 E-cadherin 61.51±7.73 29.29±5.15 7.364＜0.05 hepaCAM 72.15±9.55 36.26±6.17 8.394＜0.05 sICAM-1 35.39±4.21 60.73±7.73 7.214＜0.05 sVCAM-1 42.51±7.66 76.42±14.36 6.938＜0.05

表3 兩組患者接受不同治療方案后的蛋白酶水平比較(±s，ng/ml)

表3 兩組患者接受不同治療方案后的蛋白酶水平比較(±s，ng/ml)

組別血清沖洗液觀察組對照組t值P值MMP-2 331.53±44.73 516.65±65.31 5.394＜0.05 MMP-9 376.28±41.83 509.72±68.52 6.098＜0.05 Caspase-8 203.48±32.18 95.38±10.38 7.332＜0.05 MMP-2 214.53±32.76 376.59±35.08 6.342＜0.05 MMP-9 301.77±33.62 421.68±56.73 6.894＜0.05 Caspase-8 163.28±16.32 68.37±7.83 6.774＜0.05

3 討論

膀胱癌腫瘤侵犯膀胱壁范圍一般遠比臨床所見廣泛，故在臨床治療中膀胱癌組織被徹底切除的可能性較低，術后易復發。為了防止膀胱癌術后復發，通過尿道插入導尿管進行膀胱腔內化療或者免疫治療是目前應用最多的方法[3]。用于膀胱腔內灌注的化療藥物常用的有絲裂霉素、吡柔比星，常用的免疫調節劑是卡介苗(BCG)，BCG可以有效激活機體的免疫反應，使體內產生白介素-2(IL-2)及干擾素-γ(INF-γ)等淋巴因子，在增強機體免疫力的同時促進腫瘤細胞凋亡，最終提高抗腫瘤作用[4]。但是BCG的單獨應用具有嚴重的不良反應，包括血尿、膀胱刺激、繼發性免疫缺陷、尿道黏膜損傷等，使其臨床應用受到極大限制。鑒于BCG的良好應用效果與較大的不良反應，諸多學者推薦將其與化療藥物組成序貫治療方案，在避免BCG過度不良反應的基礎上協同發揮兩者作用。

細胞黏附分子CD44v6是一種細胞表面跨膜糖蛋白分子，定位于人類第11號染色體短臂上，由組成型及變異體外顯子共同編碼完成，有研究表明CD44v6與多種腫瘤發生及轉移均關系密切，且隨著移行細胞癌分化降低及浸潤深度增加其表達逐步減弱[5]。可見CD44v6的表達可以造成癌細胞之間以及癌細胞與基底部的粘連，使得腫瘤不易脫落擴散，延緩腫瘤進展，故在膀胱移行細胞癌中CD44v6的表達情況與患者預后關系密切[6]。E-cadherin是一種鈣依賴性細胞粘附分子，可以介導同型細胞連結、維持細胞正常形態的完整性，其表達缺失是上皮細胞-間質轉化發生的標志，已經證實E-cadherin表達在人類諸多惡性上皮腫瘤中下降甚至缺失[7]。hepaCAM是最近發現的一種免疫球蛋白超家族類細胞粘附分子，其通過增強細胞-基質粘附、抑制細胞增殖能力而影響腫瘤的侵襲轉移能力[7]。國內外研究已經證實hepaCAM表達異常與肝癌、乳腺癌、腎癌的基質粘附能力改變關系密切。上述研究結果顯示經過聯合膀胱灌洗后觀察組患者的血清及沖洗液中CD44v6、E-cadherin、hepaCAM蛋白表達量均大幅增高，提示以上三種粘附分子均參與了膀胱癌腫瘤細胞的侵襲轉移過程，而加入免疫調節劑進行聯合膀胱灌洗有助于抑制腫瘤進展與擴散、降低腫瘤侵襲能力[8]。

EpCAM是由腫瘤相關鈣信號轉導基因編碼的一個單次跨膜蛋白，參與β-連環蛋白依賴的Wnt級聯反應，激活c-myc、cyclinA/E等原癌基因表達并產生致瘤作用[9]。目前已知EpCAM高表達于乳腺癌、卵巢癌等上皮性腫瘤組織中，作為腫瘤診斷及治療指標受到越來越多關注。sICAM-1和sVCAM-1屬于黏附分子免疫球蛋白超家族，其產生途徑包括細胞內mRNA直接剪接變異體翻譯、膜型分子經蛋白酶裂解后脫落兩種[10]。sICAM-1與sVCAM-1在各種炎癥免疫反應的監測及調控中發揮重要作用，同時在腫瘤生長轉移過程中的細胞間連接中亦扮演重要角色，已經證實其在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤患者的血清中表達增高。sICAM-1與sVCAM-1是腫瘤細胞膜表面抗原之一，對腫瘤的免疫應答產生一定作用，故其釋放水平與腫瘤大小及腫瘤惡性程度均相關[11-12]。上述研究顯示觀察組患者接受聯合灌洗治療后的血清及沖洗液中的EpCAM、sICAM-1、sVCAM-1蛋白表達水平降低，提示加入免疫調節劑進行聯合灌洗后可以增強宿主的免疫功能，尤其增強局部免疫監視能力，在遏制腫瘤的復發轉移方面具有積極作用。

MMPs是一類鋅離子依賴性蛋白酶家族，具有相似結構及氨基酸序列，以酶原形式經細胞分泌并分解為多種細胞外基質，幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分、破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，為腫瘤血管內皮細胞遷移、新生血管延伸創造條件[13]。目前MMPs家族已經分離鑒別出26個成員，其中MMP-2及MMP-9是與腫瘤關系最為密切的蛋白酶亞型，可以特異性降解基底膜主要成分Ⅳ型膠原，同時對細胞外基質進行改建，促進腫瘤新生血管的形成[14]。MMP-2位于人類染色體16q21，活化的MMP-2定位于細胞旁穿透基質的突出部位，在酶解細胞外基質Ⅳ型膠原中具有“鉆頭”作用。MMP-9屬于明膠酶，可以作用于Ⅲ型及Ⅳ型膠原，通過在酶鏈的解除域上插入3個纖維連接蛋白域，分別結合膠原酶、明膠酶及層粘連蛋白。Caspase-8在細胞凋亡過程中占據著中心位置，直接參與細胞的早期凋亡啟動、信號傳遞及晚期凋亡效應[15]。Caspase-8處于凋亡級聯反應的頂點，其基因甲基化、突變或者表達異常均會使Caspase-8蛋白表達下調，一些腫瘤細胞得以逃避機體誘發凋亡的監控。上述研究結果顯示觀察組患者接受膀胱聯合灌洗治療后，血清及沖洗液中的MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低、Caspase-8蛋白表達水平上升，提示在化療藥物灌洗中加入免疫調節劑，可以降低腫瘤侵襲能力，促進腫瘤細胞的凋亡進程。

綜上所述，化療藥物聯合免疫調節劑進行膀胱灌洗有助于優化機體黏附分子及蛋白酶的表達，降低膀胱惡性腫瘤細胞的侵襲轉移能力，促進腫瘤細胞的凋亡。

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Effect of combined perfusion of mitomycin,pirarubicin,immunomodulators on the expression of adhesion molecule,protease in serum and rinses of patients with bladder cancer.

YANG Yu,ZHU Xiao-ying,GUO Jia-xiang.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100048,CHINA

ObjectiveTo analyze the effect of combined perfusion of mitomycin,pirarubicin,immunomodulators on the expression of adhesion molecule,protease in serum and rinses of patients with bladder cancer.MethodsEighty-six patients of non-muscle-invasive bladder cancer received transurethral resection of bladder tumor(TURBT)in our hospital from October 2012 to October 2014 were selected as study objects,including 43 cases of the control group with mitomycin and pirarubicin for perfusion treatment and 43 cases of the observation group with mitomycin,pirarubicin combined with immunomodulators for perfusion treatment.The expression of adhesion molecules,protease in serum and rinses were detected after treatment.Results(1)In serum,CD44v6,E-cadherin, hepaCAM levels in the observation group were significantly higher than those in the control group,while EpCAM,sICAM-1,sVCAM 1 levels in the observation group were significantly lower.(2)In rinses,CD44v6,E-cadherin, hepaCAM levels in the observation group were significantly higher than those in the control group,while EpCAM,sICAM-1,sVCAM-1 levels in the observation group were significantly lower.(3)For protease,MMP-2,MMP-9 levels in serum and rinses of the observation group were significantly lower than those in the control group,while Caspase-8 level of the observation group was significantly higher.ConclusionCombined perfusion of mitomycin,pirarubicin immunomodulators can adjust the expression of adhesion molecules and protease in patients with bladder cancer,inhibit invasion and metastasis ability,and promote apoptosis of tumor cells.

Bladder cancer;Immunomodulators;Adhesion molecules;Protease

R737.14

A

1003—6350（2015）10—1427—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0510

2014-11-19)

吳階平醫學基金(編號：320.6750.13260)

楊 渝。E-mail：yangab316@163.com