NTRK2基因rs1187272位點多態性與精神分裂癥的首發年齡關聯分析*

戴興海胡國芹呂欽諭徐阿紅介　勇汪作為張　晨毛云峰湯家一禹順英易正輝

NTRK2基因rs1187272位點多態性與精神分裂癥的首發年齡關聯分析*

戴興海1胡國芹2呂欽諭2徐阿紅3介勇3汪作為3張晨2毛云峰1湯家一1禹順英2易正輝2

【摘要】目的探討中國漢族人群神經營養性酪氨酸激酶2型受體(NTRK2)基因rs1187272位點多態性與精神分裂癥首發年齡的關聯性。方法選取174例精神分裂患者為研究組，其中81例為早發性精神分裂癥組(早發組)，93例為非早發性精神分裂癥組(非早發組) ;202例為正常對照(對照組)。采用TaqMan法，檢測NTRK2基因rs1187272位點多態性，并使用生存分析對rs1187272多態性與發病年齡的關聯進行分析。結果(1) rs1187272等位基因及基因型分布頻率在早發組與對照組之間、非早發組與對照組之間的差異有統計學意義(P＜0.05)，但在早發組與非早發組之間的差異無統計學意義(P＞0.05)。(2) Kaplan-Meier分析顯示，研究組、早發組和非早發組危險等位基因C的頻率與首發年齡無相關性(P＞0.05 )。結論在中國漢族人群中NTRK2基因rs1187272位點多態性與精神分裂癥的首發年齡不相關。

【關鍵詞】精神分裂癥酪氨酸激酶受體基因單核苷酸多態

精神分裂癥是一種復雜的重性精神疾病，影響約1%的世界人口。精神分裂癥的癥狀通常出現在青春期或成年早期，但其發病的病因和病理機制尚未完全闡明。神經發育假說認為由于中樞神經系統神經營養因子的缺乏等導致神經發育障礙［1］，從而使精神分裂癥患者出現認知損害和行為癥狀。Mooney SM等［2］研究發現神經營養因子對中樞神經系統的發展和維護是必不可少的。Seil FJ等［3］研究表明在哺乳動物中存在4種神經營養因子，包括神經生長因子(Nerve growth factor，NGF)，腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF )［4，5］，神經營養因子-3 (Neurotrophin 3，NT-3)和神經營養因子-4(Neurotrophin 4，NT-4) ;其中BDNF和NT-4通過激活TrkB (即5HTR2A，也被稱為神經營養性酪氨酸激酶2型受體)發揮作用。

Yoon HK和Norton N等［6，7］研究確定了HTR2A基因定位于染色體13q14-21區域，跨度約為20Kb，由3個外顯子和2個內含子組成，NTRK2基因有超過200個單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNPS)。Muragaki Y等［9］研究表明NTRK2基因在中央和外周神經系統均可見表達。在中樞神經系統，NTRK2基因高表達在大腦皮質，其次是海馬、丘腦、脈絡叢、小腦的顆粒層、腦干、視網膜和脊髓。在外周神經系統，NTRK2基因高表達在頜下腺、背根神經節、骨骼肌、腎和胰腺。

Kreczmanski P等［9］和Hurlemann R等［10］研究表明，在精神分裂癥患者背外側前額葉NTRK2 mRNA表達下降。Thompson Ray M等［11］尸腦研究證明精神分裂癥患者NTRK2基因表達下降。這暗示NTRK2可能是精神分裂癥的候選基因。國內萬行軍等［12］研究結果顯示，患者組和正常對照組NTRK2基因rs1187272多態性等位基因分布及基因型分布均無明顯差異，而且不同性別之間也無差異，但將精神分裂癥發病年齡分層為小于等于25歲為早發年齡組，大于25歲為非早發年齡組時，發現該基因多態性在這兩組患者之間存在顯著差異，早發年齡組與正常對照組也存在顯著差異，而非早發年齡組與對照組之間無顯著差異，提示該基因與早發精神分裂癥有關，但該研究病例數較少，尚不能完全明確該基因與早發性精神分裂癥的關系。本研究在中國上海地區漢族人群中選擇了早發性精神分裂癥患者(首次發病年齡≤18歲) 81例、非早發性精神分裂癥患者(首次發病年齡≥25歲) 93例，正常對照組202例進行NTRK2基因rs1187272的關聯研究。

1　對象與方法

1.1對象研究組均來自上海市精神衛生中心及上海市黃浦區精神衛生中心門診或住院患者，共174例，將研究組患者分為早發組和非早發組。早發組入組標準: (1)中國漢族; (2)符合美國精神疾病診斷與統計手冊第4版(DSM-Ⅳ)的精神分裂癥診斷標準; (3)起病年齡≤18歲，精神分裂癥起病年齡定義為首次出現明顯陽性癥狀(幻覺或妄想)時的年齡，陽性癥狀的明確基于臨床精神檢查及家屬和病例記錄提供的臨床信息; (4)入組前均接受過抗精神病藥治療，而且病情穩定時間≥6個月。排除標準:為了診斷可靠性，排除首次發作患者;排除其他精神疾病及重大軀體疾病。共入組81例，其中男55例，女26例;平均年齡(47.04± 9.87)歲;總病程(30.57±9.66)年。非早發組:起病年齡≥25歲，其余標準同早發組。共入組93例，其中男74例，女19例;平均年齡(56.76±8.03)歲，總病程(26.89±7.96)年。對照組:均為醫院職工志愿者，入組標準: (1)年齡18～65歲; (2)性別不限; (3)漢族; (4)簽署知情同意。排除標準: (1)排除任何精神異常及嚴重軀體疾病者; (2)排除精神活性物質使用病史; (3)排除妊娠期及產后1年女性。共入組202名，其中男94名，女108名;平均年齡(27.42±3.60)歲。應用方差分析對研究對象的基線數據(性別和年齡)進行比較，結果發現早發組、非早發組和對照組3組之間年齡和性別比較差異有統計學意義(P=0.00)，LSD分析顯示早發組和非早發組年齡比較差異有統計學意義(P=0.00)，早發組和對照組年齡比較差異有統計學意義(P=0.00)，非早發組和對照組年齡比較差異有統計學意義(P=0.00)。應用Online software SHEsis plus軟件［13］分析性別和年齡對基因型和等位基因的影響，結果發現三組性別和年齡不匹配對但對等位基因和基因型頻率分布無顯著影響(P=0.06)。

所有研究對象在進行遺傳研究前均經過精神科醫生精神檢查系統評估。所有研究對象或家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書;本研究得到上海市精神衛生中心倫理委員會的批準(倫理委員會批件號: 2012-26R)。

1.2方法SNP位點選擇:通過NCBI dbSNP數據庫在漢族人群中查找序列+/－500bp區域內的最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency，MAF)≥20%，rs1187272被檢出。基因分型: (1)抽取研究組及對照組人群的靜脈血2 ml，2% EDTA抗凝，分離白細胞，采用天根DNA提取法(天根生物技術，中國北京)提取DNA。(2)主要儀器及試劑:血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生物技術有限公司;美國應用生物系統公司(ABI公司)的7900實時定量熒光PCR儀; TaqMan UniversalPCR MasterMix試劑盒(含有dNTP、PCR緩沖液和AmpliTaq Gold DNA聚合酶)和SNP Genotyping Product試劑盒(包括引物和探針)均從ABI公司采購。(3 ) TaqMan法檢測SNP:在ABl7900型實時定量熒光PCR儀上進行384孔板的絕對定量PCR擴增，檢測NTRK2基因SNP rs1187272，并進行等位基因、基因型比較。

1.3統計學處理使用Online software SHEsis統計軟件［13］對數據進行統計分析。一般人口學資料采用獨立樣本t檢驗及卡方檢驗;樣本統計效能通過Quanto1.2.4計算，經Quanto計算，本研究樣本在檢測比值比(OR值)＞1.5的風險等位基因時其統計效能＞80%。基因型、等位基因頻率和單體型頻率比較用χ2檢驗，吻合度檢驗確定是否符合Hardy-Weinberg平衡，基因型計算其OR值及其95%可信區間(confidence interval，CI)。所有的統計檢驗均為雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗rs1187272對照組基因型Hardy-Weinberg檢驗(χ2=133.03，df=1，P=0.00)，對照組rs1187272基因型不符合Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05) ;研究組Hardy-Weinberg檢驗(χ2=1.91，df=1，P=0.17)，研究組rs1187272基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。

2.2NTRK2 rs1187272基因型和等位基因分布比較

早發組與非早發組rs1187272等位基因及基因型分布的差異無統計學意義(P＞0.05)，等位基因C對T: OR=0.95，95% CI=0.61～1.49;早發組與對照組rs1187272等位基因及基因型分布的差異有統計學意義(P＜0.05)，等位基因C對T: OR=0.46，95% CI=0.31～0.67;非早發組與對照組rs1187272等位基因及基因型分布的差異有統計學意義(P＜0.05)，等位基因C對T: OR=0.48，95%CI=0.33～0.69。見表1。

2.3NTRK2基因rs1187272位點三組危險等位基因C與首發年齡的相關性分析Kaplan-Meier分析結果表明研究組(χ2=0.40，P=0.53)、早發組(χ2=1.66 ，P=0.203)和非早發組(χ2=0.02，P=0.88)危險等位基因C的頻率與首發年齡無相關性。見圖1、2、3。

3　討論

精神分裂癥是一種嚴重危害人類健康的精神疾病，發病率較高，其具體的病因機制尚未完全闡明，目前主要考慮為多種因素綜合作用所致［14，15］。精神分裂癥罹患人群多為青壯年，提示精神分裂癥本質上可能是一種神經發育異常疾病，因此精神分裂癥的神經發育學說成為近年來精神分裂癥發病機制研究的新熱點。Schw SG等［16］認為進一步的研究將有助于了解精神分裂癥患者中神經功能障礙的確切機制。而NTRK2基因作為神經營養性酪氨酸激酶受體在大腦的許多部位有表達，被認為可能與精神分裂癥的發病機制有關，因此常常作為神經精神障礙和神經退行性障礙的研究對象。

本研究將精神分裂癥患者細分為首發年齡≤18歲即早發性精神分裂癥和首發年齡≥25歲的非早發性精神分裂癥患者，同時納入健康對照，應用病例對照研究，探討NTRK2基因rs1187272位點多態性與精神分裂癥發病年齡的關聯性。研究結果顯示研究組(早發組和非早發組)分別和對照組NTRK2基因rs1187272多態性等位基因及基因型分布比較存在顯著性差異(P＜0.05)，等位基因C對T: OR值分別為0.46、0.48，95% CI分別為0.31～0.67、0.33～0.69，說明等位基因C攜帶者顯示出明顯的保護作用;早發組和非早發組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，等位基因C對T: OR=0.95，95% CI=0.61～1.49，提示NTRK2基因rs1187272多態性是精神分裂癥的風險因素之一，但不影響其發病年齡。但由于本研究病例數較少，而且對照組rs1187272基因型不符合Hardy-Weinberg平衡，該陽性結果可能系樣本選擇偏倚所導致的。另外生存分析顯示3組之間無統計學差異，提示NTRK基因rs1187272多態性與精神分裂癥發病年齡無相關性。這與Beuten J等［17］在美國人群中的研究，Higashi M等［18］在日本人群中的研究以及國內萬行軍等［12］在中國人群中的研究結果不盡一致。美國弗吉尼亞大學Beuten J等［17］基于家系的關聯研究顯示美國人SNPs rs1187272與尼古丁依賴有關，而在美國人群中未檢出rs1187272與精神分裂癥相關。Higashi M等［18］在日本人群中對276例精神分裂癥患者與274名正常對照進行了NTRK2基因SNP rs920776多態性與精神分裂癥的關聯分析，未發現該基因多態性與精神分裂癥有關。萬行軍等［12］將精神分裂癥發病年齡分層為小于等于25歲為早發年齡組，大于25歲為遲發年齡組時，發現患者組和正常對照組NTRK2基因多態性等位基因分布及基因型分布均無明顯差異，早發年齡組與對照組存在顯著性差異，而遲發年齡組與對照組之間無顯著性差異，提示該基因與早發精神分裂癥有關，可能是早發精神分裂癥的一個致病候選基因。本研究的運用生存分析模型來研究NTRK2基因是否與精神分裂癥的首發年齡相關，結果發現NTRK基因rs1187272多態性與精神分裂癥發病年齡之間沒有任何聯系。可能是因為精神分裂癥的發生有環境與遺傳學傾向，故多基因的綜合分析才是揭示精神疾病發病原因的有效途徑。

本研究的局限性:首先，研究組與對照組性別及年齡均不匹配，由于精神分裂癥是一種遺傳異質性疾病，遺傳設計對結果會產生影響，配對的研究比不配對的研究更適合疾病的遺傳調查;其次，rs1187272對照組基因型Hardy-Weinberg檢驗(χ2=133.03，df=1，P=0.00)，即基因型分別不符合Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05) ;最后，各研究樣本量較小，研究受到樣本量的限制，可能無法完全闡釋基因的功能。故今后深入研究的重點還在于擴充樣本以及更嚴謹的實驗設計，另外，精神分裂癥是一種遺傳異質性疾病，臨床表現變異較大，還可進一步劃分亞型進行深入研究。

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(修回日期:2014－08－04)

Association analysis of neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2(NTRK2) gene polymorphisms with the age of onset

in schizophrenic patients.

DAI Xinghai，HU Guoqin，LV Qinyu，et al.
Shanghai Huangpu district Mental Health Center，Shanghai 200122，China

【Abstract】Objective To investigate the association between polymorphism of rs1187272 in neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2 (NTRK2) gene and the age of onset in schizophrenic patients.Methods Polymorphisms of rs1187272 in NTRK2 gene were genotyped by using TaqMan SNP genotyping assay in 174 schizophrenic patients (study group，consisted of 81 early-onset schizophrenics and 93 non early-onset schizophrenics) and 202 healthy controls (control group).The association between age of onset and rs1187272 polymorphism was evaluated by using survival analysis.Results (1) There were significant differences in allelic frequency and genotype frequency of rs1187272 between early-onset subgroup and control group，as well as between non early-onset subgroup and control group (P＜0.05).But no significant difference was found in allelic frequency and genotype frequency between early-onset subgroup and non early-onset subgroup (P＞0.05).(2) Kaplan-Meier analysis indicated that the distribution of risk C allele was not significantly associated with age of onset in patients in study group，earlyonset subgroup and non early-onset subgroup (P＞0.05).Conclusion The polymorphism of rs1187272 in NTRK2 gene is not likely to be associated with the onset age of schizophrenia in Chinese population.

【Key words】Schizophrenia NTRK2 gene Single nucleotide polymorphism

(收稿日期:2014－06－03)

通訊作者:易正輝，E-mail: yizhenghui1971@gmail.com;禹順英，E-mail: yushuny@yahoo.com

*基金項目:國家自然科學基金資助項目(編號:81171272) ;上海市公共衛生優秀學科帶頭人培養計劃(編號: GWDTR201227) ;上海市黃浦區科技資助項目(編號: HGG201022)

doi:10.3969/j.issn.2095－9346.2015.01.002

【文章編號】2095－9346(2015)－01－0006－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R749.3

作者單位:1.200122，上海市黃浦區精神衛生中心2.上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心3.上海市虹口區精神衛生中心