中腦星形膠質細胞來源的神經營養因子對糖氧剝奪/再灌注誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

孫　瑞，劉　珺，沈玉君，沙曼琪，徐勝春，沈玉先

(安徽醫科大學1.基礎醫學院、2.生物藥物研究所，安徽合肥　230032;3.解放軍第306醫院心血管內科，北京　100010)

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中腦星形膠質細胞來源的神經營養因子對糖氧剝奪/再灌注誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

孫瑞1，2，3，劉珺1，2，沈玉君1，2，沙曼琪1，2，徐勝春1，沈玉先1，2

(安徽醫科大學1.基礎醫學院、2.生物藥物研究所，安徽合肥230032;3.解放軍第306醫院心血管內科，北京100010)

摘要:目的研究中腦星形膠質細胞來源的神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)對糖氧剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)誘導的人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)損傷的保護作用。方法體外培養SH-SY5Y細胞，對細胞進行糖氧剝奪(OGD) 6 h，再灌注(R) 12 h。在再灌注時期，根據是否給予重組人MANF蛋白處理(2 μmol·L(－1)，12 h)，將細胞分為正常對照組(NC)、NC+ MANF組、OGD/R組和OGD/R+ MANF組。隨后光學顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞形態的改變，MTT法檢測細胞存活率，PI染色法檢測細胞死亡率，免疫印跡法檢測內源性MANF蛋白、內質網(ER)應激相關蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表達。結果光學顯微鏡下可見OGD/R組SH-SY5Y細胞胞體變小、變圓，突起縮短或消失。進一步研究發現，MANF能明顯改善OGD/R誘導的SHSY5Y細胞存活率下降和死亡率增加。免疫印跡法檢測發現: OGD/R組細胞內源性MANF蛋白表達增高; ER應激相關蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α表達增高;促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表達明顯高于NC組。給予重組人MANF蛋白可降低OGD/R組GRP78/BiP、CHOP及cleaved caspase-3的表達水平。結論OGD/R可誘導凋亡性ER應激; MANF蛋白可通過抑制OGD/R誘導的凋亡性ER應激而對SH-SY5Y細胞具有保護作用。

關鍵詞:糖氧剝奪/再灌注;內質網應激;凋亡; MANF;非折疊蛋白反應;神經保護

組織器官在缺血后進行血液再灌注時可能導致缺血/再灌注損傷的發生。缺血缺氧可導致細胞膜通透性增加、線粒體及溶酶體損傷。再灌注時期由于氧自由基大量釋放、細胞內鈣超載、炎癥細胞浸潤等多種因素作用，可引起細胞代謝和功能障礙，發生形態和結構改變，甚至導致細胞死亡。內質網(ER)應激是啟動細胞凋亡的重要途徑之一，研究表明ER應激參與了心、腦、腎等重要器官缺血再灌注損傷的病理生理過程［1－3］。中腦星形膠質細胞來源的神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)在ER應激時特異的表達上調［4］，在腦缺血、糖尿病、缺血性心臟病等多種病理狀態下發揮保護作用［5－9］，但MANF的保護作用機制尚不十分明確。本研究發現，MANF蛋白可明顯改善OGD/R誘導損傷的SH-SY5Y細胞狀態，并對ER應激相關蛋白的改變有抑制作用，尤其是減少促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表達。本研究將為理解MANF在缺血/再灌注損傷中的保護作 用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及主要試劑SH-SY5Y細胞為本實驗室保存。高糖DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。甲基偶氮唑鹽(MTT)、DAPI、PI染料購自美國Sigma公司。ECL底物發光試劑盒購自美國Thermo公司。CHOP/GADD153抗體購自美國Santa Cruz生物公司，MANF、GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、cleaved caspase-3抗體購自美國Abcam公司，α-tubulin抗體購自美國Sigma公司。重組人MANF蛋白由本實驗室自備。Galaxy 170R三氣培養箱購自德國Eppendorf公司，熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，Synergy HT型多功能酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養SH-SY5Y細胞培養于含10%胎牛血清，100 kU·L－1青霉素及100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養基中，置于5% CO2，37℃培養箱，隔日換液1次，3～4 d傳代1次。

1.2.2缺血/再灌注損傷模型的建立收集對數生長期SH-SY5Y細胞，分為NC組和OGD/R組。待細胞貼壁后OGD/R組在糖氧剝奪期更換為預熱的無葡萄糖平衡鹽溶液(a glucose-free Earle’s balanced salt solution，BSS) : NaCl 116 mmol·L－1，KCl 5.4 mmol·L－1，MgSO4·7H2O 0.8 mmol·L－1，NaH2PO4·2H2O 1 mmol·L－1，NaHCO326.2 mmol ·L－1，Glycine 0.01 mmol·L－1，CaCl2·2H2O 1.8 mmol·L－1，pH 7.4，放入含1% O2，5% CO2，94% N2，37℃飽和溫濕三氣培養箱中，初以5 L·min－1，30 min后培養箱內O2濃度降至1%，持續充入缺氧混合氣體，維持培養箱內O2濃度低于1%，并開始計時，進行糖氧剝奪6 h。之后兩組細胞分別更換為含有2 μmol·L－1重組人MANF蛋白的DMEM培養基，在5% CO2，37℃，飽和濕度培養箱中再灌注12 h。使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態，并檢測細胞存活率及死亡率，以及ER應激相關蛋白和促凋亡相關蛋白的表達。

1.2.3MTT法檢測細胞存活率接種于96孔板的SH-SY5Y細胞，在OGD/R處理結束后加入5 g· L－1MTT溶液10 μL(終濃度為0.5 g·L－1)作用4 h。之后加入150 μL DMSO溶液，使結晶物甲臜溶解，室溫震蕩10 min，使用酶聯免疫檢測儀，測量吸光度(optical density，OD) 570 nm處各孔的吸光值。各組細胞存活率/%=(該組OD值均值－空白對照OD值均值)/(NC組OD值均值－空白對照OD值均值)×100%。

1.2.4PI染色檢測細胞死亡率SH-SY5Y細胞培養于24孔板內，預先加入含有5 mg·L－1DPAI的DMEM培養基過夜培養，襯染細胞核，避光操作。待OGD/R處理結束后，各孔加入50 mg·L－1PI染料2 μL，室溫孵育5 min，輕混勻后在熒光倒置顯微鏡下觀察，細胞核為藍色熒光，死亡細胞核為紅色熒光。隨機選取5個視野(100×)，Image-Pro Plus軟件計算各視野細胞數，計算細胞死亡率。

1.2.5免疫印跡法檢測經OGD/R處理后MANF蛋白、ER應激及凋亡相關蛋白的表達SH-SY5Y

細胞接種于6孔板，OGD/R處理結束后，使用RIPA裂解液(Tris，pH 7.4; 150 mmol·L－1NaCl，1% NP-40，0.25% sodium deoxycholate)提取細胞總蛋白，煮沸變性后，用15% SDS-PAGE凝膠分離，轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入適當稀釋度的一抗，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，PBS-Triton洗滌后ECL化學發光顯色，Adobe Photoshop CS5 Extended軟件計算灰度值并進行統計學分析。

1.3統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料以±s表示，組間數據的顯著性檢驗采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

Fig 1 Recombinant human MANF inhibits the decrease of OGD/R-induced cell proliferation

2　結果

2.1重組人MANF改善OGD/R誘導損傷的SHSY5Y細胞增殖活性光鏡下可見NC組SH-SY5Y細胞呈單層貼壁生長，多有突起(Fig 1 A1)。OGD/R組細胞體積變小，突觸變短或消失(Fig 1 A2)，MANF明顯改善該細胞的狀態(Fig 1 A3)。MTT結果顯示，OGD/R組SH-SY5Y細胞增殖能力下降，明顯低于NC組(P＜0.01)，OGD+ MANF組細胞增殖活性明顯高于OGD/R組(P＜0.05) (Fig 1B)。該結果表明重組人MANF蛋白對OGD/R誘導的細胞損傷有抑制作用。

2.2重組人MANF抑制OGD/R誘導的SHSY5Y細胞死亡PI染色可見NC組及NC+ MANF組僅有少量PI染色陽性細胞(Fig 2 A2，A5)，而OGD/R組PI染色陽性細胞明顯多于NC組(P＜0.01) (Fig 2 A8)。OGD/R+ MANF組較OGD/R組死亡細胞數明顯減少，死亡率下降(P＜0.05) (Fig 2 A11)。該結果表明，重組人MANF蛋白能抑制OGD/R誘導的細胞死亡。

Fig 2 Recombinant human MANF inhibits OGD/R-induced cell death

2.3OGD/R誘導的ER應激相關蛋白表達及MANF的作用用免疫印跡方法檢測ER應激相關蛋白時發現，OGD/R組SH-SY5Y細胞ER應激相關蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、MANF的表達均明顯高于NC組(P＜0.01) (Fig 3)，提示OGD/R可誘導SH-SY5Y細胞發生ER應激。給予重組人MANF蛋白處理后，由OGD/R上調的GRP78/BiP和CHOP的表達量均有所降低(Fig 4)。

2.4OGD/R誘導的促凋亡蛋白表達及MANF的作用在檢測ER應激相關蛋白時發現，OGD/R組促凋亡蛋白CHOP表達增加，該結果提示OGD/R可能誘導了凋亡性的ER應激。為了進一步驗證該結果，我們對caspase-3進行了檢測，結果發現，與NC組比較，激活性的caspase-3水平也明顯增加(P＜0.01)。這些結果提示OGD/R可誘導凋亡性ER應激(Fig 3)。同時發現，給予重組人MANF蛋白干預后，由OGD/R上調的CHOP和cleaved caspase-3的水平被抑制(P＜0.05) (Fig 4)。

Fig 3 Protein levels of endogenous MANF，ER stress-associated proteins，and apoptosis-associatedproteins(performed by Western blot)

3　討論

現已證實，心、腦、肝、腎及胃腸道等多種組織器官都存在缺血/再灌注損傷的現象。缺血/再灌注的發生機制尚未闡明，目前認為自由基的作用、細胞內鈣超載和白細胞的激活是缺血/再灌注損傷的主要發病環節。近年來的研究表明，ER應激在缺血/再灌注導致的細胞凋亡中具有重要作用［1－2，10］。

Fig 4 Recombinant human MANF inhibits the expression of ER stress associated proteins and pro-apoptotic protein induced by OGD/R

ER應激是啟動凋亡的主要途徑之一。ER應激觸發了一個復雜的信號網絡和細胞內非折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)過程。UPR主要通過3種跨膜效應蛋白(PERK、IRE1和ATF6)的活化，調節蛋白質的合成、修飾及降解，維持ER內環境穩定，促進細胞存活。在生理狀態下，PERK、IRE1和ATF6與GRP78/BiP結合而處于抑制狀態。發生ER應激時，PERK、IRE1和ATF6與GRP78/BiP解離，GRP78/BiP與未折疊或錯誤折疊的蛋白質結合，以促進蛋白質正確折疊，同時PERK、IRE1 和ATF6被激活［11］。PERK激活后催化其底物eIF2α發生磷酸化，使蛋白質合成暫停。IRE1α具有激酶和核糖核酸內切酶活性，可對XBP1進行剪切，生產XBP1的活性形式XBP1s，XBP1s促進蛋白質正確折疊后由ER輸出，并加強錯誤折疊及未折疊蛋白的降解，維持ER的穩態［12］。本研究發現，OGD/R可上調ER應激標志蛋白GRP78/BiP的表達及激活UPR通路效應蛋白IRE1和PERK，提示OGD/R可誘導ER應激，導致PERK/eIF2α和IRE1/XBP1s通路激活，模擬體外缺氧缺血誘導的SH-SY5Y細胞損傷過程。

ER應激是機體應對損傷的一種保護性的反應，故稱為適應性ER應激。但當刺激因素過強，或ER應激持續存在而超過機體的代償能力，則ER應激變得不可逆，從而出現凋亡性ER應激。CHOP是ER應激特異的轉錄因子，屬于轉錄因子家族成員［13］，PERK、ATF6以及IRE1都能誘導CHOP的轉錄。在正常情況下CHOP主要存在于細胞質中，含量很低，細胞處于應激狀態時，CHOP的表達量大大增加并聚集在細胞核內，過量表達的CHOP能促進細胞凋亡［14］。caspase-3是凋亡的關鍵蛋白，caspase-3經剪切后成為活化型caspase-3 (cleaved caspase-3)，水解其蛋白底物，導致細胞凋亡。本研究發現OGD/R可上調CHOP和cleaved caspase-3的水平，提示OGD/R在凋亡性的ER應激中發揮重要作用。

MANF是神經營養因子(neurotrophic factors，NTFs)家族成員，是1種分泌蛋白，在ER應激時特異性的表達上調，分子伴侶GRP78/BiP與MANF相互作用，并能調節MANF的分泌［1］。近年來的一些研究結果顯示，MANF作為1個新型的神經保護因子，可進入細胞內與凋亡相關蛋白結合發揮細胞保護作用［5］。MANF包括兩個結構域:氨基末端的鞘脂激活蛋白樣結構域，可與脂質膜相互作用，其羧基末端結構域可能具有保護細胞應對ER應激的作用。越來越多的證據表明MANF是1個ER應激反應蛋白，在體外實驗中MANF能夠保護細胞應對ER應激反應誘導的細胞死亡［4］。晶體結構表明MANF可以幫助蛋白質在ER內折疊。MANF的C-末端結構域，模體127CKGC130有兩個半胱氨酸形成，一個C-末端二硫鍵可能有助于形成半胱氨酸橋并幫助蛋白質折疊，從而減少未折疊或錯誤折疊的蛋白質引起的ER應激［15］。本研究探討MANF對OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。研究結果表明，再灌注時期給予MANF處理能夠抑制OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞的細胞活力下降，減少OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞死亡率增加，表明MANF能夠減輕OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞損傷。此外，Western blot顯示，經MANF蛋白處理之后，OGD/R誘導的ER應激標志物GRP78增加能夠被MANF明顯抑制，并且MANF能夠減少ER應激特異的促凋亡蛋白CHOP和凋亡執行分子cleaved caspase-3的表達，表明MANF通過抑制SH-SY5Y細胞ER應激抑制凋亡。因此，MANF在SH-SY5Y細胞應對ER應激誘導的損傷中起著重要的作用。本研究為理解低氧誘導的損傷機制以及MANF在缺血/再灌注損傷中的保護作用提供了實驗依據。

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Protective effects of MANF on oxygen-glucose deprivation/reperfusion-induced apoptotic ER stress in SH-SY5Y neural cells

SUN Rui1，2，3，LIU Jun1，2，SHEN Yu-jun1，2，SHA Man-qi1，2，XU Sheng-chun1，SHEN Yu-xian1，2
(1.School of Basic Medical Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2.Institute of Biopharmaceutical Research，Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 3.Dept of Cardiology，the 306th Hospital of PLA，Beijing 100101，China)

Abstract:AimTo investigate the protective effects of MANF on human neuroblastoma SH-SY5Y cells suffering fromoxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R) and the underlying mechanism.Methods SH-SY5Y cells were treated with OGD for 6 h，followed by reperfusion for 12 h.Meanwhile，the cells were incubated with 2 μmol·L(－1)recombinant human protein MANF for 12 h during reperfusion.The cell morphology was observed under an optical microscope.The cell viability was determined by MTT assay.PI staining was performed to detect the number of dead cells.Western blot was performed to determine the protein levels of endogenous MANF，glucose-related protein 78 (GRP78/BiP)，phosphorylated inositol requiring enzyme 1 (p-IRE1)，phosphorylated eukaryotic translation initiator factor 2α(p-eIF2α)，cleaved caspase-3，and C/EBP-homologous protein (CHOP).Results The cells exposed to OGD/R became smaller and round，and the neurites of the cells were shortened or disappeared.Recombinant human protein MANFbook=815,ebook=80improved the survival rate (P＜0.05) and decreased the death rate (P＜0.05) of SH-SY5Y cells treated with by OGD/R.Western blot assay showed that the endoplasmic reticulum (ER) stress-associated proteins GRP78/BiP，p-IRE1，p-eIF2α，and MANF were increased significantly after OGD/R treatment，compared with the untreated controls.However，the increases of secretion levels of apoptosis-associated proteins CHOP and cleaved caspase-3 in SH-SY5Y cells induced by OGD/R were significantly suppressed by MANF.Conclusion OGD/R up-regulates the ER stress-associated proteins and causes apoptosis.MANF inhibits OGD/R-induced cell death，which may be related to attenuating ER stress-induced apoptosis.

Key words:OGD/R; ER stress; apoptosis; MANF; UPR; neuroprotection

作者簡介:孫瑞(1984－)，女，碩士生，E-mail: 1246056597@ qq.com;徐勝春(1963－)，男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向:臨床應用解剖，通訊作者，Tel: 0551-65161147，E-mail: chun028@163.com;沈玉先(1965－)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向:功能性蛋白與藥物作用靶點，通訊作者，Tel: 0551-65113750，E-mail: shenyx@ ustc.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81173074，91129729，81372576)

收稿日期:2015－02－08，修回日期:2015－03－15

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0810－06中國圖書分類號: R322.81; R329.24; R329.25; R845.22; R977.6

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.015