生防枯草芽孢桿菌B29對黃瓜根際功能細菌及土壤酶活性的影響

高吉坤，孫雨薇，曹 旭，于麗萍，李 晶*

(1.長春恒晨生物科技有限責任公司，吉林長春 130000;2.東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150080;3.黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010)

土壤是農業生態系統中物質與能量交換的樞紐，而土壤微生物是土壤生態系統中重要的功能群體，擔負維持土壤生態系統的穩定、加快土壤生態系統中養分的循環和提高土壤對不良環境的抵御能力，也是預防土傳病害的關鍵所在［1］。土壤中一切物質轉化都有酶的參與。土壤酶大部分來自于土壤微生物，因此與土壤微生物有密切關系。影響土壤微生物活性的因素也必然影響酶的活性。

枯草芽孢桿菌B29菌株不僅對黃瓜枯萎病具有明顯的防治效果，而且灌根施用后可使黃瓜根際土壤向“細菌型”土壤轉化［2］。在此基礎上，筆者又探討了該菌株對黃瓜根際幾種主要功能細菌和土壤酶活力的影響，為枯草芽孢桿菌B29菌劑在農業生產中的應用提供微生態依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枯草芽孢桿菌B29菌液的制備。枯草芽孢桿菌B29是由黑龍江省科學院微生物研究所在黃瓜根圍土壤中分離、純化、保存。將活化好的枯草芽孢桿菌B29菌株按2%接種量轉接于50 ml的NYD液體培養基中，30℃150 r/min條件下培養48 h，采用平板稀釋計數法測定菌數為5.75×108cfu/ml，備用。

1.1.2 供試植株。哈爾濱市群力開發區小西屯保護地春季移栽黃瓜。

1.2 方法

1.2.1 試驗處理。春季黃瓜移栽時，隨機分為3組。①生防菌B29菌劑處理組，將B29菌原液稀釋至5.75×107cfu/ml，灌根處理，每株灌根250 ml，共處理60株;②化學農藥處理組，將濃度75%百菌清4 g加水稀釋至25 L，灌根處理，每株灌根250 ml，共處理60株;③空白對照組，每株黃瓜用清水灌根250 ml，共處理60株。

自黃瓜移栽當天算起，移栽后10、20、30、40 d分別取土樣。將植株根圍表土除去，取3～6 cm深且靠近植株根系土壤約40 g。每個實驗組隨機采取10株黃瓜根際土樣，分別裝到已消毒的封口袋中，做好標記，－20℃保存，待測。

1.2.2 黃瓜根際部分功能細菌數量的測定。

1.2.2.1 氨氧化細菌數量的測定。先將氨氧化細菌培養液加到試管中，每個試管加5 ml，共25個試管，再將已稀釋好的土壤菌懸液(5個梯度，每個梯度5次重復)1 ml加到裝有培養液的試管中，放在28～30℃培養箱中培養28 d后，向每只試管中滴入Griess.Ilosvay試劑1～2滴，若由紅色變為褐色，則說明該試管中有氨氧化細菌生長，采用最大或然數法計算出土壤樣品中氨氧化細菌數量。

1.2.2.2 亞硝酸氧化細菌數量的測定。先將亞硝酸氧化細菌培養液加到試管中，每個試管加5 ml，共25個試管，再將已稀釋好的土壤菌懸液(5個梯度，每個梯度5個重復)1 ml加到裝有培養液的試管中，放在28～30℃培養箱中培養9 d后，向試管中加0.3 ml濃硫酸和0.3 ml硫酸聯苯胺溶液，若呈現深藍色，則說明沒有發生脫氮作用，記錄變色試管數，采用最大或然數法計算出土壤樣品中亞硝酸氧化細菌數量。

1.2.2.3 好氣性纖維素分解菌數量的測定。先將好氣性纖維素分解菌培養液加到試管中，每個試管加5 ml，共25個試管，再將已稀釋好的土壤菌懸液(5個梯度，每個梯度5次重復)1 ml加到裝有培養液的試管中，然后將備用的濾紙貼于試管內壁，一半浸入培養液內，一半在培養液外，放在28～30℃培養箱中培養5 d后，觀察且記錄結果，而后按稀釋比率法計數。

1.2.3 黃瓜根際部分土壤酶活性的測定。脲酶采用苯酚鈉次氯酸鈉顯色法測定;過氧化氫酶活性采用滴定法測定法測定;酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定;蔗糖酶活性采用 3，5－二硝基水楊酸比色法測定［3］。

2 結果與分析

2.1 根際功能細菌數量變化

2.1.1 氨氧化細菌。氨氧化細菌又被稱亞硝酸細菌，是土壤中氮素轉化的重要參與菌株。它可將氨氧化成亞硝酸，是硝化作用的第一步，也是限速步驟。氨氧化細菌是土壤中氮素循環的關鍵氧化物質，在土壤氮素轉化中有著不可替代的作用［4］。

由圖1可知，在黃瓜移栽后10、20 d時，經枯草芽孢桿菌B29菌劑處理過的黃瓜根際土壤中氨氧化細菌數量高于對照組，且差異在0.01水平顯著;百菌清藥液處理后黃瓜根際的氨氧化細菌數量在第10天時明顯低于對照組，且差異在0.01水平顯著。比較化學殺菌劑處理組與菌劑處理組根際氨氧化細菌數量，可以看出在黃瓜移栽后10、20 d，生防菌劑處理組數量要明顯高于化學農藥處理組，差異在0.01水平顯著。在處理第30、40天時，氨氧化細菌數量在各處理組間已無明顯差異，此時氨氧化細菌數量已基本不受百菌清藥液的影響，枯草芽孢桿菌B29菌劑處理組此時對氨氧化細菌的生長已無明顯的促進作用。由此可知，枯草芽孢桿菌B29的施加在黃瓜生長前期可以促進黃瓜根系土壤中氨氧化細菌的生長，并且能及時地供給植物所需氮素，促進植物的生長;化學殺菌劑的施加不利于氨氧化細菌的生長，在施加一段時間后氨氧化細菌數量已基本恢復到初始時的數量。

2.1.2 亞硝酸氧化細菌。亞硝酸氧化細菌又稱硝酸細菌，可將土壤中的亞硝酸鹽氧化成可被植物吸收利用的硝酸鹽，進而提高了土壤中可被利用氮素的含量。圖2為不同處理組黃瓜根際土壤中亞硝酸細菌在不同時間的數量變化。從生防菌B29菌劑處理后的10、20 d的測定結果可以看出，生防菌B29菌劑處理過的黃瓜根際土壤中亞硝酸氧化細菌要明顯高于其他兩組，且差異在0.01水平顯著，說明短時間內生防菌B29施加能促進黃瓜根系土壤中亞硝酸細菌的生長;在10、20 d時，化學殺菌劑處理組的亞硝酸細菌數量要明顯低于生防菌B29處理組，且差異在0.01水平顯著;與對照組相比，在10、20 d時化學農藥處理組亞硝酸氧化細菌數量要低于空白組，在10 d時亞硝酸氧化細菌數量明顯低于空白組，且差異在0.05水平顯著，由此可知化學農藥的施加會抑制亞硝酸氧化細菌的生長;在處理30 d后，各組差異不顯著，此時生防菌B29和化學農藥對亞硝酸氧化細菌的影響已基本解除。

2.1.3 好氣性纖維素分解菌。好氣性纖維素分解菌是土壤中一種主要的功能細菌。它可將纖維素分解成葡萄糖，增加土壤中有機碳的含量，分解產物葡萄糖可被作物根系吸收利用。纖維素分解菌的數量可以從側面反映土壤中有機碳源的含量，是土壤肥力的一個生物指標。

圖3表示不同處理黃瓜根際土壤中好氣性纖維素分解菌的數量隨時間變化的趨勢。在施加生防菌后第10、20天測得的好氣性纖維素分解菌的數量均高于其他兩組，且差異在0.05水平顯著，隨著好氣性纖維素菌數量的增多，土壤內有機碳含量也會相應增加，土壤肥力提高，同時為植物提供生長所必需的養分，促進植物的生長;在處理30 d后，各處理組好氣性纖維分解菌數量差異不顯著，此時生防菌B29菌劑對好氣性纖維分解菌已無影響。在處理后不同時間段，化學殺菌劑處理組的好氣性纖維分解菌數量均與對照組無差異。

2.2 不同處理后黃瓜根際土壤酶活性變化

2.2.1 脲酶。脲酶是氮轉化的關鍵酶。它主要來源于微生物和植物代謝，其活性的變化主要取決于土壤中氮元素的含量［5］。

不同處理對土壤中脲酶活性的影響見圖4。生防菌B29菌劑的施加能促進提高脲酶活性，在處理后第10、20天生防菌B29處理組脲酶活性高于其他2個處理組，且差異均在0.01水平顯著，說明生防菌B29的施加在黃瓜生長前期有利于提高脲酶活性;化學殺菌劑處理組土壤中脲酶活性在黃瓜生長前期(移栽后10、20 d)在0.01水平顯著低于生防菌劑處理組和對照組，在黃瓜生長后期(移栽后30～40 d)化學殺菌劑處理組與其他兩組中的脲酶活性已無明顯差異，此時化學殺菌劑和生防菌B29對脲酶活性都已無明顯影響，說明化學殺菌劑在黃瓜生長前期(移栽后10、20 d)內會降低土壤中脲酶活性，后期脲酶活性恢復到與對照組基本一致的水平。

2.2.2 過氧化氫酶。過氧化氫酶是一種穩定的氧化物分解酶，能將過氧化氫分解成水和氧氣，進而解除過氧化氫對植物的毒害作用。不同處理對土壤中過氧化氫酶活性的影響見圖5。在施加生防菌B29后，黃瓜根際土壤中過氧化氫酶活性在短期內(10、20 d)在0.01水平顯著高于空白對照組和百菌清藥液處理組，且為百菌清藥液處理組酶活性的1.7倍以上;隨著黃瓜的生長發育，生防菌B29處理組的土壤中過氧化氫酶活性略有下降;在施用30 d后，生防菌B29處理組與其他2組相比差異均不顯著，此時生防菌B29對土壤中過氧化氫酶活性已無顯著影響;百菌清藥液處理后10 d，黃瓜根際土壤中過氧化氫酶活性在0.01水平顯著低于空白對照組。由此可知，枯草芽孢桿菌B29菌劑對黃瓜根際過氧化氫酶活性的提高有促進作用，而化學殺菌劑則對黃瓜根際過氧化氫酶活性有較明顯的抑制作用。

2.2.3 蔗糖酶。蔗糖酶又稱“轉化酶”，是糖苷酶之一，可將蔗糖催化為果糖和葡萄糖的一種分解酶，廣泛存在于微生物和動植物體內，主要受溫度、底物濃度的影響。從圖6可以看出不同處理對土壤中蔗糖酶活性的影響。在黃瓜生長初期(10、20 d)，生防菌B29處理組測蔗糖酶活性要明顯高于其他2組處理，且差異在0.01水平顯著，說明生防菌B29菌劑施加一定時間(20 d)內可以提高土壤中蔗糖酶的活性;在黃瓜生長初期(10 d)，施加化學殺菌劑組土壤中蔗糖酶活性在0.05水平顯著低于空白組中蔗糖酶活性，說明化學殺菌劑的施加抑制了蔗糖酶活性，不利于植物根系的養分吸收。隨著處理后時間的推移，生防菌B29和化學殺菌劑對黃瓜根際蔗糖酶活性的影響均不再體現。

2.2.4 磷酸酶。土壤中的磷酸酶是一類能參與土壤中有機磷化合物合成的一種酶，其活性主要由土壤中微生物數量、種類及植被所影響。磷酸酶活性是鑒定土壤肥力一項重要指標。從圖7可以看出，在施加生防菌B29后30 d內磷酸酶活性在0.01水平顯著高于其他兩組，說明生防菌的施加促進土壤內無機磷鹽的溶解，提高土壤肥力，進而緩解植物在生長期對磷元素的需求;在施用40 d時，磷酸酶活性與空白組相比無差異，說明此時生防菌B29已不再影響磷酸酶活性。施加化學殺菌劑組的磷酸酶活性在10 d時在0.01水平顯著低于空白組，此時化學農藥對磷酸酶活性有明顯的抑制作用，但在以后的時間段(20、30、40 d)其酶活性與空白組無差異。

3 討論

研究表明，施加枯草芽孢桿菌B29后，前期(10、20 d)土壤內氨氧化細菌數量要明顯高于空白組，后期(30、40 d)其數量與對照組基本一致。亞硝酸氧化細菌、好氣性纖維素分解菌變化規律亦是如此。由此可知，枯草芽孢桿菌B29的施加能促進黃瓜根際土壤中功能細菌的生長。化學殺菌劑處理組土壤中氨氧化細菌、亞硝酸細菌的數量在前期(10、20 d)時在0.05水平顯著低于空白組。該結果與張桂山［6］在多菌靈、呋喃丹對湖南紅壤土壤微生物和酶活性效應的研究結果一致，即施加多菌靈后的一段時間內對土壤中硝化細菌生長有明顯的抑制作用;好氣性纖維素分解菌則受影響不大，在整個生長周期中與空白組數量差異不顯著。由此可知，化學殺菌劑的施加對土壤中部分功能細菌的生長有抑制作用。

而施加枯草芽孢桿菌B29有利于提高土壤中脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶的活性，且這些土壤酶活性隨時間的變化趨勢基本一致，均為先升高后降低。該結果與王輝［7］辣椒疫病生防ASD菌株對土壤微生態調控機理研究結果基本一致，即ASD菌株施加到辣椒根圍土壤后，土壤脲酶活性、酸性磷酸酶活性、蔗糖酶活性及脫氫酶活性均有不同程度的提高，只有過氧化氫酶活性提高不顯著。羅珍等［8］在接種AM真菌對玉米秸稈降解及土壤微生物量碳、氮和酶活性的影響中指出，接種AF真菌到玉米根際，對土壤中酸性磷酶、過氧化氫酶活性和蛋白酶活性均有顯著提高，形成明顯不同于非根際的微生物區系。劉慧芬［9］在刺槐根瘤固氮菌放氫對根際土壤微生物的影響研究中發現，刺槐根瘤固氮放氫能提高土壤微生物代謝強度，脫氫酶、過氧化氫酶、脲酶、轉化酶等土壤酶活性有顯著的升高。魏海燕［10］在枯草芽孢桿菌、春雷霉素對黑土微生物的生態影響中指出，各質量分數處理的春雷霉素對土壤中的細菌、真菌和放線菌均有促進生長的作用，且25 000、50 000 mg/kg處理組的促進作用最為明顯，由此得知生防菌的施加有利于土壤酶活性的提高，間接地促進微生物生長，增加土壤中微生物的生物量，對土壤肥力的提高、健康程度的增加都有積極的促進作用。研究中，化學殺菌劑百菌清施用后10、20 d，黃瓜根際土壤脲酶活性要顯著低于空白組，過氧化氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶活性在處理10 d時在0.05水平顯著低于空白組，說明化學殺菌劑對土壤酶活性有抑制作用。土壤酶活性是土壤質量的主要參數之一。土壤酶活性降低也間接導致土壤質量肥力變差，因此在農業生產中應盡量避免施加化學殺菌劑，以減少其帶來的危害。

由此可知，生防菌不僅抑制病菌的繁殖，而且可以有效改善作物根際微生態環境。它作為植保新途徑為生態農業的發展注入新活力。

［1］DORAN J W，COLEMAN D C，BEZDICEK D F，et al.Defining soil quality for a sustainable environment［J］.American Journal of Alternative Agriculture，1995，10:46 －47.

［2］高吉坤，曹旭，于麗萍，等.枯草芽孢桿菌B29對黃瓜根際土壤微生物的影響［J］.安徽農業科學，2013，41(7):2922 －2923，2947.

［3］周禮愷，張志明.土壤酶活性的測定方法［J］.土壤通報，1980(5):37－38，49.

［4］余濼，高明，慈恩，等.不同耕作方式下土壤氮素礦化和硝化特征研究［J］.生態環境學報，2010(3):733 －738.

［5］潘丹丹，張志卿.四川丘陵區典型邊坡土壤酶活性的季節動態［J］.水土保持通報，2013(1):111－114.

［6］張桂山.多菌靈、呋喃丹對湖南紅壤微生物和酶活性的效應及多菌靈降解細菌的分離鑒定與降解性研究［D］.杭州:浙江大學，2004.

［7］王輝.辣椒疫病生防ASD菌株篩選及對土壤微生態調控機理研究［D］.沈陽:沈陽農業大學，2012.

［8］羅珍，朱敏，王曉鋒，等.分根裝置中接種AM真菌對玉米秸稈降解及土壤微生物量碳、氮和酶活性的影響［J］.中國生態農業學報，2013(2):59－63.

［9］劉慧芬.刺槐根瘤固氮放氫對根際土壤微生物的影響［D］.西安:西北大學，2010.

［10］魏海燕.枯草芽孢桿菌、春雷霉素對黑土微生物的生態影響［D］.烏魯木齊:新疆農業大學，2009.