烘箱煨制雷公藤藥效毒性及成分變化研究

劉建群，張國華，高俊博

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 南昌 330004)

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烘箱煨制雷公藤藥效毒性及成分變化研究

劉建群，張國華，高俊博

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 南昌 330004)

目的：研究烘箱煨制雷公藤的藥效、毒性及成分變化。方法：采用黃泥包裹雷公藤帶皮根藥材，烘箱加熱煨制得雷公藤煨制品。分別采用大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型、小鼠急性肝損傷模型及高效液相色譜法評價雷公藤煨制品抗炎活性、急性毒性以及成分變化。結(jié)果：雷公藤經(jīng)過150℃和200℃烘箱加熱煨制后治療佐劑性關(guān)節(jié)炎效果顯著提高，優(yōu)于生藥，肝毒性顯著下降。雷公藤經(jīng)烘箱煨制后，4個成分含量下降，1個成分含量增加，新產(chǎn)生成分2個。結(jié)論：首次報道了烘箱煨制對雷公藤的藥效、毒性及成分的影響。烘箱煨制對雷公藤具有確切的減毒增效作用，可大大提高雷公藤的臨床應(yīng)用安全性，值得推廣應(yīng)用。

雷公藤；烘箱煨制；藥效；毒性；有效成分

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于嚴(yán)重危害人們健康的十類重大疾病之一，發(fā)病率高、危害嚴(yán)重、治愈率低[1]。雷公藤(TripteryginumWilfordii) 系衛(wèi)茅科植物，味辛、苦，性涼，有大毒，歸心、肝、脾、腎經(jīng)，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、舒筋活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲止癢之功。雷公藤是公認(rèn)的具有良好療效的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫功能亢進(jìn)性疾病的首選中藥，療效顯著[2-3]。但是雷公藤毒性很大，具有肝、腎、心、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等毒性，是目前不良反應(yīng)報道最多的中藥之一[3]。炮制是有毒中藥降低毒性的傳統(tǒng)有效方法，目前，關(guān)于雷公藤的炮制方法主要有凈制法[4]、煮法[5-6]、炙法[6]、蒸法[6-8]、浸泡法[9]及其他炮制方法[10]。凈制法去掉了毒性最大但也是活性最大的根皮，該法雖然降低了毒性但同時降低了雷公藤的治療效果，造成資源大大浪費(fèi)。上述炮制方法雖然對雷公藤的毒性有一定的降低效果，但多數(shù)文獻(xiàn)未對雷公藤炮制品和生品的藥效進(jìn)行對比研究，而且采用的藥材絕大多數(shù)為去皮凈制的雷公藤藥材。目前，有關(guān)雷公藤炮制研究比較薄弱，缺少抗炎、免疫抑制等活性對比研究，雷公藤許多現(xiàn)有炮制方法療效還未明確，探索雷公藤炮制物質(zhì)基礎(chǔ)變化的文獻(xiàn)報道也較少，缺少帶皮雷公藤藥材的炮制研究。煨制是常用炮制方法之一，具有“緩和藥性、增強(qiáng)療效”的作用。 本文首次報道了烘箱煨制對雷公藤帶皮根藥材的毒效及其化學(xué)成分的影響，豐富了雷公藤炮制方法。烘箱煨法炮制減毒增效效果好，而且利用雷公藤的帶皮根藥材，資源利用充分，炮制過程簡便，工藝可控性強(qiáng)，容易規(guī)范化和推廣，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。

1 材料與儀器

雷公藤根于2011年采自江西省萍鄉(xiāng)市，原植物由作者劉建群教授鑒定為雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.F.)。雷公藤甲素對照品(購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度>99%，批號ZL110619)，甲醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水為二次蒸餾水，中性氧化鋁(分析純，上海納輝干燥試劑廠)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)，完全弗氏佐劑(CFA,Sigma公司產(chǎn)品)。其余試劑為分析純。

昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，許可證號：SCXK(贛)2011-0001。健康SD雄性大鼠，體重(220±15)g。由湖南斯萊克景達(dá)動物有限公司提供SCXK(湘)2013-004。

Agilent1200高效液相色譜儀(四元泵、柱溫箱、VWD檢測器和Agilent 1200 色譜工作站)；十萬分之一分析天平(AE-240，瑞士梅特勒)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廈門精藝興業(yè)科技有限公司)，Z-16K型高速低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)，SABA PM4000全自動生化分析儀(意大利AMS公司)。YLS-7B足趾容積測量儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 雷公藤烘箱煨制

將雷公藤帶皮根藥材均分為3份，每份40g，分別為生藥組、150℃烘箱煨制組和200℃烘箱煨制組。烘箱煨制組藥材用黃泥( 將黃土與10%食鹽水按每4g黃土中加入1mL食鹽水的比例和勻) 均勻包裹，包層厚度約0.3cm，分別置于150℃和200℃的烘箱中煨制45min，剝離黃泥，即得。

2.2 雷公藤提取物制備

將生藥組、烘箱煨制組藥材，切碎，采用10倍量70%乙醇回流提取3次(1.5h、1.5h和1h)，提取液合并濃縮，減壓蒸干得到各組雷公藤提取物。

2.3 藥效試驗動物分組及處理

采用大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型評價雷公藤生藥與煨制品的治療作用。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組、雷公藤生藥組、150℃烘箱煨制組和200℃烘箱煨制組，每組10只，造模前測右后足容積，而后除對照組外，其余各組左后足皮內(nèi)注射0.1mL完全弗氏佐劑造模，對照組注射等量生理鹽水。自致炎第12天起開始給藥每天1次，雷公藤和各炮制組給藥劑量為4.5g/kg(劑量均按生藥計)，連續(xù)12天，并測定右后足容積，每4天測1次，分別為第12、16、20、24、28天，并在致炎后第12、16、20、24、28天觀察并記錄四肢關(guān)節(jié)病變程度，測量繼發(fā)側(cè)足腫脹體積△V。

2.4 毒性試驗動物分組及處理

取昆明種小鼠40只，18～22g，雌雄各半，實(shí)驗室適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白對照組、生藥組、150℃烘箱煨制組和200℃烘箱煨制組。生藥組烘和箱煨制組分別給予相應(yīng)雷公藤提取物，對照組給予等量蒸餾水。給藥前，小鼠禁食過夜，自由飲水，給藥組分別于次日灌胃給藥1次，6h后再灌胃給藥1次，給藥劑量為16.25g/kg(按生藥計)。第二次給藥18h后小鼠眼眶取血，3 500r/min離心10min得血清，按試劑盒操作說明生化分析儀檢測ALT 和AST水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2.6 高效液相色譜分析

2.6.1 供試樣品制備 將上述生藥組、150℃和200℃烘箱煨制組提取物，用甲醇溶解并定容至50mL。精密量取1mL，上中性氧化鋁柱(2g，粒度160～200目，內(nèi)徑1.2cm，5mL洗脫劑預(yù)洗)，用20mL含5%無水乙醇的氯仿溶液洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至1mL，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.6.2 液相色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)，流動相為甲醇∶水(45∶55)，流速為1mL/min，檢測波長為218nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣方式為手動進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20μL。

3 結(jié)果

3.1 治療佐劑性關(guān)節(jié)炎試驗結(jié)果

結(jié)果(表1)表明，生藥組、150℃烘箱組和200℃烘箱組小鼠與模型組側(cè)足腫脹體積比較，P均<0.05，說明這3組與模型組存在明顯差異，治療效果顯著，150℃和200℃烘箱煨制品治療效果均優(yōu)于生藥。其中200℃烘箱組跟空白對照組比較無顯著差異，數(shù)據(jù)顯示在12天時小鼠有明顯足腫脹，而后逐漸消退恢復(fù)，說明200℃烘箱組的治療效果最為理想。

表1 烘箱煨制對雷公藤治療大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎藥效的影響 (±s，n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，ΔP<0.05；與生藥組比較，#P<0.05。

3.2 肝功能檢測結(jié)果

從表2可以看出，雷公藤生藥組、150℃烘箱煨制組和200℃烘箱煨制組小鼠ALT和AST水平均比正常對照組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明雷公藤及其炮制品有一定的肝毒性。烘箱煨制組小鼠ALT和AST水平均比生藥組低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明雷公藤烘箱煨制組毒性比生藥組低，而且隨著炮制程度的增加肝毒性下降。

3.3 高效液相色譜分析

雷公藤生藥組和烘箱煨制組藥物HPLC色譜圖見圖1，比較色譜圖的對應(yīng)色譜峰面積可以看出，雷公藤在烘箱煨制后，4個成分含量下降，為色譜峰2、3、5和6，保留時間tR分別為11.51、13.56、18.33和30.63min，其中色譜峰5下降幅度最大，烘箱煨制后幾乎消失，根據(jù)對照品確定色譜峰2為雷公藤甲素，說明烘箱炮制后雷公藤甲素稍有下降。一個成分含量增加，為色譜峰4，保留時間tR為14.88min，增幅較大，而且隨炮制程度的增加而增幅增大。新產(chǎn)生成分兩個，為色譜峰1和7，保留時間tR為6.23min和33.61min，其中色譜峰7增幅較大，而且隨炮制程度增加增幅增大。各組色譜峰面積變化趨勢見圖2。

圖1 雷公藤生藥組和烘箱煨制組藥物HPLC色譜

表2 各組藥物對小鼠肝功能的影響 (±s,n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與生藥組比較，ΔP<0.05。

圖2 烘箱煨制后色譜峰1～7峰面積變化趨勢

4 討論

雷公藤經(jīng)黃泥包裹，150℃和200℃烘箱煨制后毒性比生藥顯著降低，而其治療佐劑性關(guān)節(jié)炎效果顯著提高，大大優(yōu)于生藥。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤經(jīng)烘箱煨制后，4個成分含量下降，1個成分含量增加，新產(chǎn)生成分2個，其中主要有效成分也是主要毒性成分的雷公藤甲素含量稍微下降。推測烘箱煨制對雷公藤的減毒增效作用可能與這些成分變化有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。本文首次報道了烘箱煨制雷公藤藥效、毒性及成分變化情況。結(jié)果表明烘箱煨制對雷公藤具有確切的減毒增效作用，可大大提高雷公藤的臨床應(yīng)用安全性，值得推廣應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2014-12-25

江西省教育廳科技項目(GJJ12516)

劉建群(1970-)，男，博士，江西中醫(yī)藥大學(xué)教授，研究方向為中藥活性成分及質(zhì)量評價。E-mail: liu5308@sina.com

R282.2

A

1673-2197(2015)10-0007-03

10.11954/ytctyy.201510004