星點設計-效應面法優選五倍子水提工藝研究

羅 悅 ，李建利,2，陳梓賢，王利潔

(1.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 611137； 2.四川省中醫藥科學院 中醫研究所，四川 成都 610031)

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星點設計-效應面法優選五倍子水提工藝研究

羅 悅1，李建利1,2，陳梓賢1，王利潔1

(1.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 611137； 2.四川省中醫藥科學院 中醫研究所，四川 成都 610031)

目的：優選香蘞痔瘡栓中五倍子的水提工藝條件。方法：采用高效液相色譜法測定沒食子酸含量并進行方法學考察；以沒食子酸含量及干浸膏收率為綜合評價指標，選取影響水溶性成分提取率的蒸餾水用量、煎煮時間作為考察因素，應用星點設計-效應面法優選最佳水提工藝條件。結果：星點設計得出的最佳提取工藝為提取時間70min，溶劑劑量為7.5倍量的水。結論：所選方法能較好地優選香蘞痔瘡栓中五倍子的水提工藝，所建立的二項式模型預測值良好。

沒食子酸；提取工藝；星點設計-效應面法

香蘞痔瘡栓為四川省中醫藥科學院中醫研究所針對痔瘡所研制的新藥，由五倍子等多味中藥組成。五倍子始載于《開寶本草》，性酸、澀、寒，歸肺、大腸、腎經，具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿、止汗、止血、解毒、斂瘡等多種功效。現代藥理學研究表明五倍子具有抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化收斂等作用[1-3]。五倍子的主要成分為沒食子酸，因此選擇水溶性成分沒食子酸作為有效成分的參考指標之一。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀(儀器包括：LC-20AT色譜工作站、SD-20AT紫外檢查器，日本島津公司)；電熱套；FA1104N型電子天平；KQ5200型超聲清洗器；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋DHG-91；40A型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 試藥

五倍子飲片(四川省中藥飲片有限責任公司，產地：四川，批號130723)；沒食子酸供含量測定的對照品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200802)。甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 沒食子酸含量測定

2.1.1 色譜條件 參照《中國藥典》2010年版一部中“五倍子”項下沒食子酸含量測定方法[4]進行含量測定試驗。色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0(4.6×250mm，5μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(15∶85)；流速：1mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：275nm。

2.1.2 對照品溶液制備及標準曲線繪制 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加50%甲醇制成濃度分別為0.080 4、0.160 8、0.241 2、0.321 6、0.402 0、0.804 0mg·mL-1的溶液作為對照品溶液備用。取上述對照品溶液各10μL，分別進樣并測定其峰面積。以對照品不同濃度X(mg·mL-1)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，然后繪制標準曲線，結果回歸方程為：Y=953 648X-6 386.8，r=0.999。表明沒食子酸濃度在0.080 4～0.804 0mg·mL-1范圍內，與峰面積有較好的線性關系。

2.1.3 精密度試驗 精密量取“2.1”項下對照品溶液10μL，連續進樣6次，沒食子酸峰面積的RSD為1.54%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.1.4 供試品溶液制備 量取“2.2”項下星點試驗樣品溶液5mL，用50%甲醇定容至25mL容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液即得。

2.1.5 重復性試驗 取“2.2.1”項下星點試驗11號樣品貯備液，按“2.1.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，各進樣10μL測定，結果RSD為1.76%，其中n=6，該方法重現性良好。

2.1.6 加樣回收試驗 精密吸取“2.2.1”項下星點試驗11號樣品貯備液適量，按《中國藥典》2010年版一部附錄 XVIIIA項下方法，測定沒食子酸的加樣回收率。最終得到沒食子酸平均回收率99.79%，RSD為1.78%(n=6)。

2.2 水提工藝研究

2.2.1 星點實驗設計及結果 在查閱文獻及參考預實驗結果的基礎上[5-7]，選取溶劑用量、提取時間為考察因素，提取次數確定為3次。每因素設5 水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示(2因素星點設計的α=1.414) 。因素水平見表1，試驗安排和結果見表2。

表1 因素水平

表2 實驗安排與結果

2.2.2 數據分析 實驗結果按照實驗編號進行，每次提取3次，合并3次濾液。試驗結果采用以下方法評價：OD=0.3×OD(浸膏得率)+0.7×OD(沒食子酸)。浸膏得率和沒食子酸含量采用 Hansan 方法分別轉化為 0 ～1 的“歸一值”，9～13號為重復實驗各指標結果的均值，浸膏得率和沒食子酸含量越大越好，計算歸一值。

采用Designexpert8.0.6軟件，將總體評分分別對因素AB進行多元線性回歸以及二項式擬合，多元線性回歸模型不具有顯著性，得到二項式擬合方程為OD=0.93+0.13× X2-0.095× X1-0.16×X2 × X1-0.33× X22-0.29 ×X12。P值模型為0.003，X1為0.0498，X2為0.0156，X1X2為0.0249，X12為0.0003，X22為0.000 1，均小于0.05，具有顯著性，且擬合度也較好，預測性良好。所得的影響平面圖和立體圖見圖1和圖2。由效應面圖得出最佳工藝為溶劑劑量為7.54，提取時間為67.59。根據實際情況定位7.5倍量的水，提取時間為70min。

圖1 總評分平面圖

2.2.3 驗證試驗 根據“2.2.2”項下確定的工藝條

件平行進行3次試驗，結果如表3。總評分實際平均值與預測值相比，偏差為-6.24%，說明建立的模型良好，所選取的工藝重現性良好。

3 討論

本研究選用的星點效應面法(central composite design，CCD)是國外目前常用的一種先進的實驗設計方法，運用二項式擬合，并根據星點設計所建立的數學模型描繪效應面，國內目前對于星點設計-效應面法在五倍子的研究上比較少，通過星點設計-效應面法可直觀方便地確定較優的制備工藝。該法具有精密度高、試驗次數少、預測性良好的優點。

星點設計效應面法針對非連續性數據不能夠進行很好的處理，本實驗中考察的提取時間和溶劑劑量都是連續性影響因子，而提取次數是非連續性影響因子，參考文獻將其定為3[8]。此次試驗所得到的工藝方便可行，能夠用于大生產，為香蘞痔瘡栓的研究奠定了基礎。

表3 驗證試驗結果

[1] 樸春梅.五倍子的研究近況[J].中國民間療法,2005,13(2):63-65.

[2] 李紅然,付大友.五倍子中有效成分提取方法研究進展[J].廣東化工,2010,37(10):71,79.

[3] 周勁光.五倍子的藥理作用與臨床研究進展[J].海峽藥學,2010,22(4):30-32.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:62.

[5] 陳笳鴻,畢良武.塔拉粉直接堿水解制備沒食子酸的工藝研究及應用[J].林產化學與工業,1995,15(1):1-8.

[6] 楊躍輝,姜清華,林智娟.HPLC法測定五倍子油膏中沒食子酸的含量[J].化學與生物工程,2010,27(6):90-91.

(責任編輯：尹晨茹)

2015-01-07

四川省科技廳支持項目(2014-2-12)

羅悅(1990-)，女，成都中醫藥大學碩士研究生，研究方向為藥劑學。

李建利(1957-)，男，四川省中醫藥科學院主任藥師，成都中醫藥大學碩士生導師，研究方向為中藥新制劑、新劑型與新技術。

R284.2

A

1673-2197(2015)10-0031-02

10.11954/ytctyy.201510013