HDAC2 基因RNA 干擾載體的構建*

劉燕青，黃 健，黃韻祝＊＊＊，婁方方，孔維瑩

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫科大學附院 生化科，貴州 貴陽 550004)

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)2 屬于I 類HDACs 家族成員，在腫瘤的發生發展中具有重要作用［1］。HDAC 能調控細胞信號轉導和基因表達，當HDAC 過量或乙酰基轉移酶(HATs)的數量減少時，組蛋白乙?；钠胶鈱⑵蛉ヒ阴；?，從而導致基因表達的調節異常［1］。RNA 干擾(RNAi)技術是目前使用最廣泛的功能基因組學研究手段，屬于轉錄后基因沉默，具有高效率、高特異性、高穩定性和高穿透性等優點［2］。本實驗參照HDAC2 基因序列，設計合成短發夾RNA(shRNA)結構的雙鏈寡核苷酸片段，插入慢病毒表達載體pLKO.1-puro，構建并篩選針對人HDAC2 基因特異性的慢病毒干擾載體，為進一步研究HDAC2 在腫瘤發生和發展中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pLKO.1-puro 慢病毒表達載體(美國addgene公司)，LB 培養基(OXID)，T4 DNA 連接酶、限制性內切酶AgeI、EcoRI 和XhoI(NEB 公司)，DNA 凝膠回收試劑盒、無內毒素質粒大提試劑盒、質粒小提中量試劑盒(北京TIANGEN 公司)，stbl2 大腸桿菌(實驗室保存)，20 bp、1 kb DNA Ladder(Takara)，氨芐青霉素(sigma 公司)，陽離子脂質體LipofectamineTM2000、DNA 測序試劑盒(Invitrogen 公司)，引物由上海捷瑞生物公司合成;熒光倒置顯微鏡(NIKON)，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 特異性shRNA 干擾載體的設計 人HDAC2 shRNA 靶點設計:根據Sigma 公司干擾靶點 信 息(http://www.sigmaaldrich.com/catalog/genes/HDAC2?lang=zh＆region=CN)，挑選出3條基因特異性shRNA 序列(Human，HDAC2，NM_001527)，通過BLAST 同源性分析，排除非特異性抑制其他基因序列的可能。序列3＇端加入終止信號TTTTT，兩端分別加入限制性內切酶AgeI 和EcoRI 的酶切位點黏性末端，中間加入Loop 環，構成的引物結構(AgeI 酶切位點+Sense+Loop+Antisense+終止信號+EcoRI 酶切位點);HDAC2-shRNA 序列見表1。

表1 針對人HDAC2 基因序列設計的寡核苷酸片段Tab.1 Oligonucleotide sequences of HDAC2 specific shRNAs

1.2.2 Oligo DNA 片段退火、線性質粒載體pLKO.1-puro 獲得 將合成的八條Oligo 片段用pH 8.0 的TE 溶液稀釋成100 μmol/L，按照下列體系進行退火反應，正向序列引物1 μL，反向序列引物1 μL，10×NEB buffer2 5 μL，雙蒸水(ddH2O)43 μL;反應條件為95 ℃、5 min，70 ℃10 min，室溫自然冷卻，形成雙鏈Oligo DNA 片段，4%瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈Oligo DNA 的完整性，產物于-20℃保存。挑取攜帶pLKO.1-puro 質粒的甘油菌接種含100 mg/L 氨芐青霉素(Amp)的LB 平板，37 ℃培養過夜。次日挑5 個單克隆增菌，提取質粒。在37 ℃用AgeI 和EcoRI 雙酶切500 ng pLKO.1-puro 質粒載體使之線性化，酶切產物用0.8%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，凝膠切割回收7 kb 的pLKO.1-puro 骨架大片段，20 μL ddH2O 洗脫。

1.2.3 感受態細胞制備 挑取4 ～6 個單克隆菌落接種于5 mL LB 液體培養基，37 ℃，220 r/min振蕩過夜。按1∶50 ～100 比例將上述菌液接種到100 mL LB 培養基，37 ℃，220 r/min 搖菌5 ～6 h，將菌液置冰上冷卻，4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，回收菌體，加入預冷的0.1mol/L CaCl2重懸，再4℃，4 000 r/min 離心10 min，回收沉淀，向細胞沉淀中加入冰上預冷的含15%甘油的CaCl2溶液重懸，分裝，放入-80 ℃保存備用。

1.2.4 pLKO.1-HDAC2-shRNA 質粒構建 將各組退火后的雙鏈Oligo DNA 片段與線性化pLKO.1-puro 干擾載體進行連接，連接體系:雙鏈Oligo DNA 2 μL，線性化pLKO.1-puro 20 ng，10×NEB T4 DNA ligase buffer 2 μL，加ddH2O 至19 μL，在1μL T4 DNA 連接酶的作用下于16 ℃連接過夜;連接產物轉化大腸埃希菌stbl2 感受態細胞，-80 ℃取出100 uL/支stbl2 感受態細胞置冰上融化，各組分別加入9 μL 連接產物，冰上靜置30 min，42 ℃熱激90 s，迅速冰浴3 min，然后加入891 uL LB 液體培養基，37 ℃，200 r/min 振蕩培養1 h。待細菌復蘇后離心取沉淀涂布含100 mg/L 氨芐青霉素(Amp)的LB 平板，37 ℃正置培養30 min，待平板上液體完全吸收，然后倒置培養過夜。

1.2.5 重組質粒篩選與鑒定 線性化pLKO.1-puro 與目的基因shRNA 序列連接轉染大腸桿菌stbl2 感受態細胞，挑選5 個單克隆菌落接種到含100 mg/LAmp 的LB 培養基，37 ℃，200 r/min 振蕩培養16 ～18 h。提取重組質粒載體分別進行XhoI、EcoRI 單酶切驗證。酶切反應條件為重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 10 μL，XhoI 或EcoR I 1 μL，Buffer 5 μL，加ddH2O 至50 μL，置37 ℃孵育2 h，70 ℃、15 min 終止反應，pLKO.1-puro 質粒采用AgeI、EcoRI 酶切，重組質粒經EcoRI，pLKO.1-HDAC2-shRNA 經XhoI 單酶切驗證，酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結果，pLKO.1-puro 質?？梢? kb 和1.9 kb 兩條特異性條帶，重組質粒經EcoRI 后可見1 條約7 kb 特異性條帶，pLKO.1-HDAC2-shRNA 經XhoI 單酶切后可見6 567 bp、295 bp、190 bp 及39 bp 的4 條特異性條帶，提示外源序列插入成功。挑取酶切鑒定證實為陽性克隆的重組質粒菌液送上海Invitrogen 公司進行DNA 測序鑒定。對測序正確序列的克隆進行擴大培養，采用無內毒素質粒大提試劑盒抽提質粒，并用紫外分光光度計測定濃度及純度，分裝，-20 ℃保存。

2 結果

2.1 寡核苷酸退火產物的鑒定

將3 組針對HDAC2 基因靶點特異性shRNA及陰性對照退火后行4%瓊脂糖凝膠電泳，結果在60 bp 處可見目的條帶，與預期相對分子大小相符，說明干擾片段退火成功，見圖1。

2.2 重組質粒酶切鑒定

pLKO.1-puro 質粒經AgeI、EcoRI 酶切后經瓊脂糖凝膠電泳得到7 kb 和1.9 kb 兩條特異性條帶，見圖2;pLKO.1-puro 骨架經凝膠回收后電泳可見7 kb 目的條帶，見圖3。重組質粒經EcoRI 單酶切后可見1 條約7 kb 大小的目的條帶，見圖4;pLKO.1-HDAC2-shRNA 通過XhoI 單酶切可見6 567 bp、295 bp、190 bp 及39 bp 的4 條目的片段，見圖5;提示外源序列插入成功。

圖1 HDAC2-shRNA 寡核苷酸退火產物Fig.1 Mapping of HDAC2-shRNA oligonucleotide annealed product

圖2 慢病毒載體pLKO.1-puro AgeI與EcoRI 單雙酶切鑒定圖Fig.2 Enzyme digestion and identification of lentiviral vector pLKO.1-puro by AgeI and EcoRI

圖3 pLKO.1-puro 凝膠回收大片段電泳圖Fig.3 Recovered large fragment of pLKO.1-puro by gel electrophoresis

圖4 重組慢病毒載體pLKO.1-HDAC2-shRNA的EcoRI 酶切鑒定圖Fig.4 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA by EcoRI

2.3 重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 測序鑒定

重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 測序結果經BLAST 軟件分析，基因HDAC2-shRNA 已成功克隆入慢病毒干擾載體pLKO.1 中，原始序列與已知序列的BLAST 結果完全一致，證實設計序列正確插入載體且無突變(見圖6)，表明合成的3 對干擾靶點和陰性對照均已成功構建成重組質粒，符合預期設計。

圖5 重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA的XhoI 酶切鑒定圖Fig.5 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA by XhoI

圖6 重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 測序鑒定結果Fig.6 DNA sequence of pLKO.1-HDAC2-shRNA recombinant plasmid

3 討論

HDAC 是維持組蛋白乙?；降年P鍵酶之一，組蛋白的去乙?；饔门c基因轉錄抑制密切相關，涉及基因沉默的諸多過程，在腫瘤的發生發展過程中HDAC 起著重要作用［3］，HDAC 通過組蛋白或轉錄因子等其他蛋白的轉錄后修飾調節基因轉錄。正常情況下，機體內組蛋白的乙?；腿ヒ阴；幱趧討B平衡狀態，這種平衡的打破將成為癌癥產生的直接誘因［3］。組蛋白乙酰化由HDAC 和HATs 兩個家族的酶共同調控，當HDAC 過表達或HATs 減少時，在腫瘤細胞中組蛋白大多呈低乙酰化狀態，從而導致基因表達的調節異常［4-5］。HDAC2 屬于Ⅰ類HDAC，是腫瘤的治療過程中的一個重要的潛在目標。研究發現，HDAC2 可通過多種機制達到促癌作用，而HDAC2 的敲除可導致某些腫瘤細胞生長停滯和凋亡［6-8］。

RNAi 技術是將內源或外源雙鏈RNA 與細胞內的同源序列mRNA 相結合并使之降解的技術，是一種序列特異性的轉錄后基因沉默(posttranscriptional gene siliencing，PTGS)，是目前基因功能及基因治療方面的研究熱點［9］。有研究發現，短發夾shRNA 能夠增加細胞的轉染效率，并能有效敲減目的基因的表達［10］。RNAi 的作用機制是雙鏈RNA 被特異的核酸酶降解，產生小片段的干擾RNA，這些干擾RNA 能與同源的靶RNA 互補結合，使靶RNA 降解，從而導致基因表達受到抑制。該方法具有效應強、持續時間長，在細胞中表達穩定和遺傳好等優點，RNAi 研究方法的出現，被廣泛應用于基因功能分析等，應用RNAi 技術沉默靶基因的表達，有助于進行靶基因功能以及靶基因下游相關基因等研究［2］。本實驗選擇慢病毒表達質粒載體pLKO.1-puro，構建能夠表達shRNA 的真核表達載體，此載體含有U6 啟動子和轉錄終止信號poly(T)。質粒轉染細胞后，在U6 啟動子作用下轉錄出單鏈RNA，從而折疊形成特異性的短發夾結構(shRNA)，在細胞內進一步加工成siRNA，發揮長期的RNA 干擾效應。該質粒載體含有Amp抗性基因以便篩選克隆菌株，使其能夠在含有Amp 的LB 培養基中大量擴增獲取重組質粒;在載體結構上存在嘌呤霉素抗性基因，在進行慢病毒感染篩選時，以獲得帶有目的基因的穩定細胞株。

在本研究中，首先設計針對HDAC2 靶點特異性的寡核苷酸序列，采用基因重組技術將shRNA序列插入線性化的慢病毒表達載體pLKO.1-puro中，實驗結果表明，對陽性克隆經酶切鑒定及基因測序驗證均證明插入序列完全符合預期結果，沒有堿基缺失或替換，成功構建了3 條pLKO.1-HDAC2-shRNA 干擾質粒載體和一條陰性對照載體，為后續HDAC2 基因的相關實驗研究奠定了基礎。

［1］Wang SS，Li XM，Parra M，et al.Control of endothelial cell proliferation and migrationby VEGF signaling to histone deacetylase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008(22):7738-7743.

［2］王繼峰.RNAi 基因沉默技術［J］.中國生物化學與分子生物學會中醫藥專業委員會年年會文集，2005(1):29-37.

［3］Kr?mer OH.HDAC2:a critical factor in health and disease［J］.Trends Pharmacol Sci，2009(12):647-655.

［4］Hayashi A，Horiuehi A，Kikuchi N，et al.Type-specific roles of histone deacetylaseHDAC overexpression in ovarian carcinoma:HDAC1 enhances cell proliferation and HDAC3 stimulates cell migration with down-regulation of E-cadherin［J］.Int J Cancer，2010(6):1332-1346.

［5］Liu T，Xu F，Du X，et al.Establishment and characterization of multidrug resistant，prostate carcinoma-initiating stem like cells from human prostate cancer cell lines 22RV［J］.Mol Cell Biochem，2010(12):265-273.

［6］Zhu P，Martin E，Menqwasser J，et al.Induction ofHDAC2 expression upon loss of APC in colorectal tumorigenesis［J］.Cancer Cell，2004(5):455-463.

［7］Fritsche P，Seidler B，Schüler S，et al.HDAC2 mediates therapeutic resistance of pancreatic cancer cells via the BH3-only protein NOXA［J］.Gut，2009(10):1399-1409.

［8］Ropero S，Ballestar E，Alaminos M，et al.Transforming pathways unleashed by a HDAC2 mutation in human cancer.Oncogene，2008(27):4008-4012.

［9］Ashihara E，Kawata E，Maekawa.Future prospect of RNA interference for cancer therapies［J］.Curr Drug Targets，2010(3):345-360.

［10］蔡明俊，雷霆，郭東生.RNA 干擾技術在膠質瘤治療中的應用［J］.中國臨床神經外科雜志，2007(5):319-321.