單細胞多重替代擴增法結合比較基因組雜交技術檢測植入前發育停滯胚胎染色體非整倍性

石青青，孫海翔

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 婦產科，江蘇 南京 210008)

胚胎染色體的非整倍性改變可影響胚胎的發育［1］。臨床上很多體外授精的胚胎在植入前體外培養的過程中即出現發育停滯，使用標準的形態學方法很難鑒別此胚胎染色體是否為非整倍性染色體，這需要使用植入前遺傳學診斷技術來鑒定［2－3］。比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)技術是在熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，FISH)基礎上發展起來的的一種分子細胞遺傳學技術，僅需少量DNA 經過一次雜交就可以對全基因組進行全面的評估，該技術還無需細胞培養和預先了解需檢測的染色體區域，但臨床上為了減少胚胎的損傷，僅能取單個卵裂球進行PGD 檢測，而單個卵裂球所包含的DNA量有限，不足以用于CGH 檢測。全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)技術是一種非選擇性擴增全基因組DNA 序列的技術，它能如實反映基因組全貌，并對DNA 大量復制［4］。本次研究應用WGA 技術中穩定性強、特異性高、保真性好的多重置換擴增法(MDA)結合CGH 技術對70枚植入前發育停滯卵裂球進行檢測，篩查植入前胚胎非整倍性染色體，分析植入前發育胚胎發育停滯的病因機制。

1 對象和方法

1.1 研究對象

從生殖中心2011 年植入前6 ～8 細胞期發育停滯的胚胎中，隨機選取70 枚，通過透明帶激光打孔輔助卵裂球吸拉法，每枚胚胎各取出卵裂球一枚，分別放入0.5 mL PCR 管內。正常男性肝素抗凝新鮮外周血2 mL，經淋巴細胞分離液分離得到單個核淋巴細胞，梯度稀釋于生理鹽水內，于倒置顯微鏡下挑取單個淋巴細胞，放入0.5 mL PCR 管內，待用。

1.2 方法

1.2.1 MDA 和染色體標本制備 MDA 及其產物檢驗試劑(single cell WGA kit)購于美國Sigma 公司，步驟:(1)裂解細胞，去離子水9 μL 及新鮮制備的裂解緩沖液1 μL(包含蛋白酶K 及10×單細胞裂解緩沖液)，PCR 程序，50 ℃、1 h，99 ℃、4 min;(2)模板制備，1×單細胞模板制備緩沖液2 μL及模板穩定液1 μL，PCR 反應，95 ℃、2 min，置于冰上冷卻，加入模板制備酶1 μL，PCR，16 ℃、20 min，24 ℃、20 min，37 ℃、20 min，75 ℃、5 min，4 ℃、10 min;(3)擴增，加入10×擴增混合液7.5 μL，去核酸水48.5 μL，WGA DNA 聚合酶5 μL;PCR，95 ℃、3 min，94 ℃、30 s，65 ℃、5 min，共25 個循環;4 ℃、10 min。通過比色法及1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增結果，用常規方法制備正常男性淋巴細胞中期染色體。(此為Sigma 公司MDA 商品化試劑盒內的試劑，以及試劑盒內附操作步驟)

1.2.2 CGH 雜交 (1)單細胞WGA 產物沉淀:在擴增產物PCR 管中加入3 mol/L NaAc 5 μL，－20℃無水乙醇125 μL，混合均勻后瞬時離心，放入－70 ℃沉淀1 h。4 ℃12 000 r/min 離心30 min，吸去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2 次。4 ℃12 000 r/min 離心5 min，吸去上清液。于空氣中干燥。(2)DNA 切口平移與熒光標記:50 μL 體系，沉淀DNA 的PCR 管內加入10×PolyI buffer 5 μL，dTTP 5 mL，dNTP 10 μL，PolyI 2 μL，Spectrum Green/Spectrum Red dUTP 2.5 μL，DnaseI 1 μL，去離子水24.5 μL。漩渦振蕩混勻后瞬時離心，15 ℃酶切，片段大小集中在250 ～750 bp，PCR 儀上70 ℃10 min 終止反應。單個卵裂球擴增產物標記綠色熒光作為待測樣本，正常男性外周血單個淋巴細胞擴增產物均標記了紅色熒光作為對照樣本。(3)雜交:兩種標記探針各取30 μL，混合后加入人類Cot－1 DNA 10 μL，3 mol/L 醋酸鈉5 μL、無水乙醇125 μL，充分混勻，－80 ℃沉淀1 ～2 h。4 ℃12 000 r/min 離心30 min，用75%乙醇洗滌沉淀，吸去上清液，于空氣中干燥。探針溶于10 μL 雜交緩沖液(50%去離子甲酰胺，2×SSC，10%硫酸葡聚糖、pH=7.0)，將探針和染色體玻片共變性73 ℃5 ～6min;37 ℃孵育箱中雜交48 ～72 h 雜交。(4)洗片及分析:0.1%NP40/2×SSC，37 ℃，洗片3 min;在黑暗中常溫干燥;加抗熒光淬滅DAPI 30 μL。(5)CGH 圖像的獲取以及分析Lecia 熒光顯微鏡下選擇中期染色體分散，信號光滑背景較低的區域用ASI 分析軟件進行分析，每一染色體上綠紅2 種信號疊加后會形成一定的熒光強度比(FR)，通過分析熒光強度比，即可制作出CGH 拷貝數核型模式圖，正常染色體的綠紅比值為0.85 ～1.15，綠紅比值≤0.75 時判斷為染色體丟失，≥1.25 時判斷為染色體擴增。

2 結果

在檢測的70 枚卵裂球中，有7 枚出現染色體的非整倍性改變，其中2 枚卵裂球染色體為46，XY，dup(Y)(q12);其余5 枚卵裂球的染色體分別為45，X;47，XY+21;47，XY+1;46，XY，dup(17)(q23);46，XX，dup(20)(p12)。染色體異常的發生率為10%。見圖1。

3 討論

自1993 年Munné 對人類胚胎非整倍性篩查開始至今，很多體外授精病人的妊娠失敗都是由于胚胎的非整倍性造成的［5－6］。但是不同類型的染色體非整倍性改變對胚胎發育的影響不同，并且染色體非整倍性改變出現在胚胎發育的不同階段對于胚胎發育的影響也不同。在人類活產嬰兒中，13、18、21 和性染色體的非整倍體改變占染色體數目異常的95%。對于植入后發育停滯胚胎進行研究發現，常染色體三體改變最為常見，其中15、16及22 號染色體3 體異常發生率較高，其次為性染色體單體改變及結構重排［7－8］;還有一部分胚胎在著床前體外培養時就會出現發育停滯的現象。本研究立足于染色體的非整倍性改變，通過MDA 結合CGH 方法對植入前即發育停滯的胚胎進行檢測，以期發現這種發育停滯是否與染色體的非整倍性有關，以及何種類型的染色體非整倍性改變可以引起胚胎在植入前發育停滯。

本研究的70 枚植入前發育停滯的卵裂球中，7枚出現染色體非整倍性改變，且非整倍性改變的類型各不相同，染色體異常的發生率為10%，表明本研究中染色體異常的發生比例較高，且非整倍性改變的類型與既往研究的妊娠胚胎發育異常的類型不同［9］。本次研究挑選6 ～8 細胞期的胚胎卵裂球，最大限度降低了染色體嵌合現象(即同一胚胎的不同卵裂球中的染色體組成不一致的現象)引起的異常染色體的漏檢。本次研究的不足是CGH技術，檢測擴增和缺失的靈敏度約為2 Mb，一些微小的擴增或缺失無法檢測，導致實際染色體非整倍性改變比例應高于檢測比例。因此，植入前發育停滯的胚胎中的胚胎存在染色體非整倍性改變比例應高于10%，說明染色體非整倍性改變可能導致植入前胚胎的發育停滯。

圖1 植入前發育停滯卵裂球染色體非整倍性改變Fig.1 Chromosome aneuploidy of blastomeres of arres ted development before implantation

胚胎發育停滯原因復雜，與自然妊娠的胚胎發育停滯不同，植入前胚胎發育停滯可能與下列因素有關:(1)氧自由基傷害，胚胎在早期對于外源性氧化損傷的敏感性很高，自身抗氧化保護的機制發育尚未完全;有學者發現，用胚胎在體外培養時，培養液中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增高后可引起小鼠早期胚胎發育阻滯，當外源性地補充抗氧化的酶類后，就可以避免體外培養和操作帶來的ROS 損害［10－11］;(2)培養液成分不平衡，與體細胞不同，早期胚胎發育代謝機制具有其特殊性;體內環境中不同的養分以不同的量和形式存在，它們彼此保持著一定的平衡關系，也正是這種平衡體系為胚胎發育提供了適合的發育環境;培養液平衡體系一旦打破，那勢必會影響胚胎的發育;阻滯就不可避免;(3)胚胎冷凍損傷，主要認為是由于胚胎的線粒體等受損從而誘導細胞發生凋亡，造成胚胎發生阻滯［12－14］。

本次研究成功應用單細胞MDA 結合CGH 技術對植入前胚胎全基因進行檢測，篩選出植入前胚胎非整倍性的染色體，表明染色體非整倍性改變可能是植入前胚胎的發育停滯的原因之一。

［1］Leeanda W.Preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in early human embryos:a review［J］.Prenat Diagn，2002(22):512－518.

［2］Bielanska M，Tan SL，Asangla A，et al.Chromosomal mosaicism throughout human preomplantation development in vitro:incidence，type，and relevance to embryo outcome［J］.Hum Reprod，2002(2):413－419.

［3］Ziebe S，Lundin K，Loft A，et al.Fish analysis for chromosomes 13，1 6，1 8，21，22，X and Y in all blastomeres of IVF pre－embryos from 144 randomly selected donated human oocytes and impact on pre－embryo morphology［J］.Hum Reprod，2003(12):2575－2581.

［4］石青青，孫海翔，胡婭莉，等.不同擴增方法和探針長度對植入前單個卵裂球比較基因組雜交檢測結果影響［J］.中華圍產醫學雜志，2011(5):277－282.

［5］Patrizio P，Bianchi V，Lalioti MD，et al.High rate of biological loss in assisted reproduction:it is in the seed，not in the soil［J］.Reprod Biomed Online，2007(1):92－95.

［6］Voullaire L，Wihon L，McBain J，et al.Chromosome abnormalities identified by comparative genomic hybridizationin embryos from women with repeated im plantation failure［J］.Mol Hum Reprod，2002(8):1035－1041.

［7］Malmgren H，Sahlen S，Inzunza J，et al.Single cell CGH analysis reveals a high degree of mosaicism in human embryos from patients with balanced structural chromosome aberrations［J］.Mol Human Reprod，2002(8):502－510.

［8］Dagan W，Joy DA.Comprehensive chromosomal analysis of human preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative genomic hybridization［J］.Molecular Human Reproduction，2000(6):1055－1062.

［9］李妍，徐建，徐艷文，等.植入前遺傳學診斷周期中染色體易位對胚胎發育的影響［J］.中山大學學報(醫學科學版)，2013(6):877－882.

［10］Lee TH，Kirn SU，Yu SL，et al.Peroxiredoxin II is essential for sustaining life span of erythrocytes in mice［J］.Blood，2003(12):5033－5038.

［11］Hmwey AJ，Kind KL，Thompson JG，et al.REDOX regulation of early embryo development［J］.Reproduction，2002(4):479－486.

［12］Sturmey RG，Hawkhead JA，Barker EA，et al.DNA damage and metabolic activity in the preimplantation embryo［J］.Human Reproduction，2009(1):81－91.

［13］George A.Thouas，Alan O，et al.Mitochondria1 dysfunction in mouse oocytes results in preimplantation embryo arrest vitro［J］.Biology of Reproduction，2004(6):1936－1942.

［14］Thouas GA，Trounson AO，Jonesn GM，et al.Developmental efects of sublethal mitochondrial injury in mouse oocytes［J］.Biology of Reproduction，2006(5):969－977.