肺泡形成基因P311 在支氣管肺發育不良中的作用*

曾寶梅，王予川，黃 棟＊＊＊，王 楠

(1.貴州醫科大學 兒科學教研室，貴州 貴陽 550004;2.貴州省人民醫院 兒科，貴州 貴陽 550004)

隨著圍產醫學的發展和新生兒救治水平的提高，許多危重新生兒尤其是早產兒得以生存。作為主要救治方法中的氧療，在改善患兒低氧血癥，提高機體血氧含量的同時，因長時間高濃度氧氣的吸入，造成嬰兒高氧相關性支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)的發生［1］，導致患兒產生氧依賴，臨床上出現反復下呼吸道感染、敗血癥、持續肺動脈高壓及肺心病等并發癥，嚴重影響患兒的生活質量。如何促進肺泡的再發育是治療該病的關鍵，肺泡形成基因P311 是與肺泡發生相關的一種階段特異表達基因，在肺泡發育中起著重要作用［2］。研究發現，BPD 的病理改變主要為肺泡發育阻滯，肺泡體積增大，數目減少［3］。本研究通過復制BPD 動物模型，觀察肺泡形成基因P311的mRNA 表達水平變化，探討P311 基因在改善BPD 中肺泡發育阻滯，促進肺泡再發育的作用。

1 材料及方法

1.1 主要材料與試劑

有機玻璃氧艙、醫用氧氣、氧壓表、鈉石灰、變色硅膠、4%多聚甲醛、動物組織RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(Invitrogen)、引物(上海生工)、SYBR Mixture(With ROX)、八聯管、實時熒光定量PCR 儀(Bio－Rod)。

1.2 實驗動物與分組

普通級成年昆明小鼠30 只，購自貴陽醫學院動物中心，其中雌鼠20 只，雄鼠10 只，按雌雄比2∶1 的比例隨機合籠，次日觀察陰栓，見陰栓者記為妊娠0.5 d，雌鼠孕第18.5 天時行剖宮產，取出的胎鼠，復蘇存活后視為早產鼠。取64 只早產鼠隨機分配給近日已自行分娩的母鼠喂養(代乳鼠)，每只代乳鼠帶8 ～10 只早產鼠。早產鼠適應性飼養約6 h 后隨機分為空氣組及高氧組，空氣組和高氧組根據取肺組織的時間分為第1 天組、第3 天組、第7 天組和第14 天組，每組8 只。

1.3 方法

1.3.1 BPD 動物模型復制 動物模型復制按參考文獻［4］方法進行，高氧組均置于氧艙(自制60 cm×40 cm×40 cm 密閉的有機玻璃容器，頂部一進氣孔，直徑0.5 cm，側面有1 個等大的排氣孔，進氣孔持續通入醫用氧氣，容器內置有飼料、水、鈉石灰、變色硅膠以及墊料)中喂養，用測氧儀監測氧艙內的氧濃度＞90%，氧艙內溫度與室內溫度約25℃，濕度60%，CO2濃度＜0.5%。每天定時開艙添加飼料和水，并更換小鼠墊料。每日將高氧組與空氣組的代乳鼠互換，以避免高氧組代乳鼠因氧中毒致護理能力降低?？諝饨M置于同一室內空氣中飼養。

1.3.2 肺組織病理學檢查 采用蘇木精－伊紅染色法，早產鼠分別于空氣和高氧環境中飼養第1、3、7 及14 天后取左肺組織4%多聚甲醛固定，蘇木精－伊紅染色后，光鏡下觀察各組肺組織的病理變化。

1.3.3 P311 基因mRNA 檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real－time PCR)法，根據Genebank 提供的P311 基因序列構建引物，同時設計GAPDH 作為內參，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P311 基因上游引物序列:3’－ctggactgaaggaagggagaat－5’，下游引物序列為3’－ttcggttcacttccttaggca－5’。取第1、3、7 及14天兩組小鼠的右肺組織，按照動物組織RNA 提取試劑盒的步驟，提取肺組織總RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，并用核酸蛋白分析儀檢測RNA 的純度及濃度。按照逆轉錄試劑盒的步驟迅速將RNA 逆轉錄合成cDNA，Real－time PCR體系為(With ROX)SYBR Mixture 12.5 μL、Forward Primer 0.5 μL、Reverse Primer 0.5 μL、cDNA 1uL、Free－water 10.5 μL，循環條件為95℃ 10 min，95℃15 s、60℃1 min、65℃5 min;40 個循環。最后收集數據進行統計分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，比較采用重復測量設計資料的方差分析檢驗和多個樣本均數的兩兩比較，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況

空氣組反應比較靈敏，鼻尖紅潤，毛發光澤，呼吸均勻;高氧組隨著吸氧時間的延長，逐漸表現為反應遲鈍，體重增長緩慢，毛發發澀、無光澤，鼻尖發紺，呼吸急促;停止吸氧后，小鼠表現為呼吸稍困難，鼻尖明顯發紺，煩燥，反應差。

2.2 肺組織病理變化

肉眼觀察:空氣組肺組織呈均勻淡紅色，包膜光滑、組織彈性良好;高氧組肺組織表面有散在甚至彌漫的淤血點，小血管擴張、充血。鏡下觀察發現第1 天時，兩組肺組織均表現為肺泡結構不規則，肺泡數目少、腔較大，肺泡間隔較厚(見圖1A、B);第3 天時，兩組肺泡體積漸變小，間隔漸變薄，高氧組肺泡腔內有炎性細胞浸潤(見圖1C、D);第7 天時，空氣組肺泡體積變小，肺泡數目漸增多;高氧組部分肺泡腔增大，肺間質增生(見圖1E、F);第14 天時，空氣組肺泡數目漸增多，分化良好，逐漸肺泡化。高氧組肺泡腔內間質增生，少數肺泡融合，肺泡數量減少，肺泡結構簡單化(見圖1G、H)。

圖1 早產小鼠肺組織病理變化(HE，×400)Fig.1 The pathological changes of lung tissue of premature mice

2.3 P311 基因mRNA 表達

第3 天時兩組P311 基因mRNA 表達量最高，隨后下降。高氧組P311 基因mRNA 表達水平高于同一時間點空氣組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 早產小鼠肺組織P311 基因mRNA 表達水平Tab.1 The P311 gene expression in the lung tissue of premature mice

3 討論

BPD 由Northway 等人首次提出，盡管氧氣對于生命而言是必須的，但超過生理限線的氧氣濃度對于器官、細胞而言都具有危害性。肺臟成為長時間暴露在高氧環境下最易受損的器官［5］。研究發現在肺發育的關鍵時期長時間吸入氧氣會導致肺發育受損，在機體脫離氧氣后肺組織可自行修復，但有時易損傷的肺組織并不能完全修復，最終發展為BPD。體積大、數量少的囊泡發展為體積小、數量多的肺泡是肺發育成熟的標志［6－7］。將小鼠置于高濃度氧氣環境中的第3 天均可出現肺組織形態學改變，觀察至第14 天時可見不同程度的肺泡發育障礙及肺泡簡單化表現。該過程與人類BPD病理過程極其相似［8］。

P311 是肺泡發生相關階段特異表達的基因，有多種生物學功能，與本研究相關的是P31l 可導致細胞分化為肌纖維細胞，并增加細胞的增殖及存活率［9］，而肌纖維細胞在肺泡隔膜的形成中起著非常重要的作用。在肺組織發育的過程中，從原始肺泡到肺泡的演變，最典型的形態特征就是次級隔膜的發生和生長，隔膜的形成包含隔膜在特定位點的發生、隔膜的延伸以及隔膜上血管內皮細胞、肺上皮細胞和間質細胞的重排等一系列過程。雖然這一過程的機制還不是很清楚，但通常認為新基底膜的生成、上皮細胞和肌成纖維細胞在隔膜頂端的生長以及彈性蛋白的沉積起了重要的作用［10］。在這個過程中單獨的肺泡壁可能在肺泡開口處形成一些游離“末端”，而這種末端能以一定的角度與其他肺泡壁結合形成“彎曲”，也能在一個所謂“聯結點”與兩個肺泡壁結合。彈性纖維和肺泡肌成纖維細胞位于呼吸過程中收縮力所在的末端和彎曲，而不是由膠原纖維控制的聯結點。肺泡壁上的這些彎曲被認為是新生次級隔膜發生及延伸的位點，當機械力作用于沿彎曲分布的彈性纖維時，彈性纖維被拉離肺泡壁，啟動新隔膜的形成［11］。次級隔膜發生、重建所必須的彈性蛋白正是由肌纖維細胞產生的［12］。因此推測P311 可能與肺泡的形成密切相關，進而對整個肺組織的發育具有重要作用［13］。

本研究成功構建了BPD 動物模型，然后通過Real－time PCR 檢測P311 基因在早產小鼠肺組織中的mRNA 表達水平發現，P311 基因mRNA 表達水平在早產后第3 天肺組織中出現高峰，然后下降維持低水平存在，說明P311 基因可促進早產小鼠發育不成熟的肺組織肺泡的發育，導致P311 在早產后第3 天出現高峰，然后維持低水平存在;同時，高氧組P311 基因mRNA 表達水平高于同一時間點空氣組(P ＜0.05)，考慮高氧組小鼠肺組織除本身發育不成熟以外，還因長期吸入高濃度氧氣而受損，說明P311 基因可能是影響肺損傷修復的調控因子，可能是通過調節肺泡上皮細胞和肺成纖維間質細胞再生和轉分化，促進肺泡分隔膜的形成，抑制肺間質纖維化形成來影響肺的修復［14］。

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