重組腺病毒Ad—GFP—C197的構建及其抗腫瘤活性研究

鄔賢 陳嘉盛 曹瑩 丘玉昌 龐建新

摘要：端粒酶是維持端粒長度的重要組成部分，是腫瘤發生的標志物之一。構建了能表達人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）C端936-1132氨基酸片段（C197）的重組腺病毒Ad-GFP-C197，并觀察其對Hela細胞增殖的影響。結果顯示，Ad-GFP-C197感染Hela細胞后，采用免疫印跡法檢測到C197在細胞內得到高效表達。此外，Ad-GFP-C197明顯抑制Hela細胞的增殖，誘導細胞凋亡，并且降低Hela細胞中端粒酶活性。上述研究為進一步研究hTERT C末端功能打下基礎，并為腫瘤的生物治療提供新的思路。

關鍵詞：重組腺病毒；Hela細胞；人端粒酶逆轉錄酶；C197；細胞凋亡；端粒酶活性

中圖分類號：R966 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）03-0237-05

端粒是在染色體末端維持染色體穩定的帽狀結構，含有特征性的TTAGGG重復片段。細胞每一次分裂均會使TTAGGG片段的丟失，最終導致DNA缺損，引起細胞死亡。端粒酶是一種核糖核蛋白，能特異性地在染色體DNA末端加上TTAGGG片段，防止端粒縮短。絕大多數人體細胞中檢測不到端粒酶的活性[1]。與此相反，在85 010的腫瘤細胞中檢測到了端粒酶活性[2]。端粒酶對腫瘤的發生發展起到重要的促進作用[3]。

人端粒酶主要組成部分包括RNA（ humantolemerase RNA，hTR）和逆轉錄酶（human telom-erase reverse transcriptase，hTERT）。hTR作為模板，在hTERT的作用下使端粒末端得以延長。hTERT有3個結構域，分別是N末端部分，具有逆轉錄活性的中間部分（逆轉錄區），以及一小段C末端序列[4]。N末端主要是與hTR結合部位，C末端主要是與DNA結合部位，這兩部分是hTERT與其他逆轉錄酶的主要區別。逆轉錄區是催化活性部位，幾乎所有的逆轉錄酶在該區的活性基團都高度保守。目前對hTERT不同片段的研究較多的是將hTERT的N末端和逆轉錄區的保守基因進行缺失突變或識別hTERT自然存在的不同mRNA剪切體，觀察這些突變體或剪切體對腫瘤細胞增殖的影響和端粒酶活性[5-7]。另外，一些剪切體可以翻譯成蛋白質，表現出不同的生理和病理功能，如抑制細胞增殖、抑制Wnt信號途徑等端粒外功能[8，9]。

目前對hTERT C末端的研究較少，有研究表明，hTERT的C末端可調節hTERT在細胞內定位[10]，對端粒酶的功能不可或缺[11]。在前期的研究中，我們曾經構建了表達hTERT C末端197個氨基酸（hTERT 936-1132，C197）的真核表達質粒[12]，但表達量不高。在此基礎上，本研究構建了能大量表達C197片段的重組腺病毒Ad-GFP-C197.為進一步研究hTERT的C末端功能打下基礎。同時還發現，過表達C197可明顯抑制Hela細胞增殖，促進其凋亡，降低細胞端粒酶的活性，為腫瘤的生物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料1

.1.1 菌種、細胞系、載體

BJ5183、DH5α、HEK293細胞、Hela細胞、重組腺病毒系統AdFJasy-l（包含骨架質粒PAdEasy-l和穿梭質粒PAdTrack-CMV）均由本實驗室保存。

1.1.2 實驗試劑和設備

胎牛血清、高糖培養基購自美國Hyclone公司；SalI和Ecor V限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Ex -Tag酶、Pme I酶、PacI酶均購自美國Thermo公司；小量質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自美國OMEGA公司；Trizol試劑盒購自上海生物技術有限公司；臺盼蘭試劑盒購自碧云天公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；PVDF膜、TRAP法端粒酶活性檢測試劑盒均購自美國Millipore公司；ECL顯色試劑盒購自美國Thermo公司；EB溶液購自美國Sigma公司；6-his tag抗體、凝膠成像分析儀（美國Kodak公司）；GDPDH抗體、羊抗鼠IgG二抗均購自美國Santa公司；細胞恒溫培養箱（美國Thermo公司）；高速離心機（美國Backman公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2方法

1.2.1 目的基因獲取

根據GenBank公布的人hTERT基因序列，選取C端936-1132氨基序列片段（命名為C197），在該片段中的C端引入EcorV限制性酶切位點，在N端引入6個his標簽和SalI限制性酶切位點，片段總長度為650 bp，合成后克隆至pGSI載體（上海生工公司合成）。

1.2.2 重組腺病毒大質粒的構建和鑒定

將含有目的基因的pGSI載體進行雙酶切（Sal I和EcorV酶），酶切片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收含有his tag的C197基因。穿梭質粒PAdTrack-CMV分別用SalI和EcorV限制性內切酶進行雙酶切，隨后在T4 DNA連接酶作用下與C197基因進行連接，獲得重組質粒PAdTrack-C197。用Pme I酶線性化PAdTrack-C197，將其轉化進入到含有骨架質粒PAdEasy-l的BJ5183細菌中進行同源重組，得重組大質粒PAd-C197。以重組大質粒PAd-C197為模板，C197基因的上下游引物（上游引物序列：5'-AGGGTCGACACCAT-GCATCATCACCATCACCAT-3'，下游引物序列：5'-TGGATATCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA -3'）進行PCR擴增鑒定和基因序列測序，同時用SalI和EcorV限制性內切酶對質粒進行雙酶切鑒定。

1.2.3 重組腺病毒Ad-GFP-C197的包裝

將重組大質粒PAd -C197進行Pac I線性化，用脂質體2000將線性化產物轉染進入HEK293細胞中進行腺病毒包裝，待細胞出現CPE病變現象時，收集細胞，反復凍融3次，離心（3 000 r/min，4 0C）收集上清，得到病毒原液Ad-GFP-C197。空載體對照病毒Ad-GFP按照同樣的方法進行包裝。

1.2.4重組腺病毒的純化及滴度測定

Ad-GFP-C197和Ad-GFP在HEK293細胞中擴增后，氯化銫密度梯度離心法純化病毒；最后轉入透析袋，4 0C透析過夜[13]后分裝保存，分別取一管用綠色熒光蛋白標記法[14]檢測病毒滴度。

1.2.5 C197蛋白在Hela細胞中的表達

Hela細胞接種于6孔板（每孔2xl05個細胞），分別將Ad-GFP-C197和Ad-GFP （MOI=100）轉染Hela細胞48 h，提取6孔板中細胞的總蛋白行免疫印跡實驗。

1.2.6 Ad-GFP-C197對Hela細胞凋亡及增殖的影響

收集Ad-GFP-C197和Ad—GFP轉染24 h、48 h和72 h的Hela細胞，按照Annexin V-PE凋亡試劑盒說明書處理樣品后上流式細胞儀進行檢測并收集數據，根據早期凋亡細胞占活細胞數的比例來計算凋亡率并進行統計；同時將Hela細胞鋪于24孔板中（每孔lxl04個），共7塊板，每組實驗6個復孔。用Ad-GFP-C197和Ad-GFP分別感染各組細胞，每天取1塊板進行實驗，用胰酶消化各組細胞，采用臺盼蘭計數法對活細胞進行計數，并繪制細胞增殖曲線圖。

1.2.7 TRAP法檢測Hela細胞的端粒酶活性

收集Ad-GFP-C197轉染24 h、48 h和72 h后的Hela細胞，Ad-GFP轉染72 h的Hela細胞以及正常的Hela細胞。分別提取總蛋白并調成一致濃度，按照TRAPEZE⑩Telomerase Detection Kit說明書操作；產物行12.50/0聚丙烯酰胺凝膠電泳后用EB溶液染色，于凝膠成像系統下拍照。

1.2.8 統計方法

均采用GraphPad Prism 5統計作圖軟件進行統計學分析。結果均以x+s表示。組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1獲得目的基因

從含有目的基因C197的pGSI質粒中，用SalI和EcorV酶進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳可見650 bp特異性條帶，大小與目的基因相符。結果見圖l。

2.2 PAd-C197大質粒的鑒定

以大質粒PAd-C197為模板，C197基因的上下游引物進行PCR，且將PAd-C197大質粒進行SalI和EcorV雙酶切，均得到目的條帶（650 bp），測序結果顯示該片段序列與我們預計的序列一致，表明重組大質粒PAd-C197構建正確，結果見圖2。

2.3重組腺病毒包裝及擴增

PacI酶切線性化的重組大質粒PAd-C197轉染至HEK293細胞，l周后鏡下可見細胞呈彗星狀綠色熒光，見圖3；表明重組大質粒在細胞內得到表達，可視為重組腺病毒包裝成功。

2.4病毒滴度的測定

Ad-GFP-C197和Ad-GFP經擴增純化后，采用綠色熒光蛋白法進行病毒滴度測定，結果顯示Ad-GFP-C197的滴度為3.14xl011 pfu/mL，對照病毒Ad-GFP的滴度為2.34xl011 pfu/mL。

2.5 C197在Hela細胞內的表達

Ad-GFP-C197轉染Hela細胞48 h后，和空載體病毒Ad-GFP組相比，Ad-GFP-C197組的C197蛋白成功表達，進一步說明了重組腺病毒Ad-GFP-C197構建成功。結果見圖4。

2.6 Hela細胞凋亡和增殖情況

與Ad-GFP組比較，Ad-GFP—C197轉染Hela細胞后，在第3d開始出現增殖抑制作用，細胞增殖速率明顯降低；在轉染后24 h、48 h、72 h，Ad-GFP-C197轉染的Hela細胞的凋亡率明顯高于Ad-GFP對照組，表明Ad-GFP-C197能明顯地抑制Hela細胞增殖并誘導Hela細胞凋亡。結果見圖5。

2.7 TRAP法檢測Hela細胞的端粒酶活性

依據TRAP方法檢測端粒酶活性，結果顯示，每一組都出現了36 bp的條帶，說明TRAP方法操作成功，陰性對照組無端粒酶活性。與端粒酶陽性對照組和空白對照組相比，Ad-GFP轉染組的端粒酶活性不受影響，而Ad-GFP-C197轉染組的端粒酶活性在第2d開始出現降低，第3d降低得更明顯。說明Ad-GFP-C197能夠明顯地抑制Hela細胞中端粒酶活性。結果見圖6。

3討論

端粒酶在除造血組織和生殖細胞外的正常組織中不表達或低表達，而在80%—90%的腫瘤中表達異常增高，所以端粒酶的激活可能是腫瘤發生過程中的關鍵因素。而端粒酶逆轉錄酶hTERT是端粒酶活性的限速酶，hTERT的表達異常增加也通常被認為是腫瘤發生前期標志[15～17]。已有研究表明在體外降低hTERT的表達，可以縮短端粒長度、誘導細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞的生長，于是hTiFRT成為抗腫瘤研究中一個新的特異性靶點[18，19]。

hTERT是由N端（RNA結合區）、逆轉錄區（催化活性區）和C端3個功能區組成，近年來大部分研究都針對N端和逆轉錄區，而C端是調節hTERT在細胞內定位的重要結構域，也是其在細胞內進行端粒末端復制所必需的結構域[20]。但目前對于hTERT的C端研究不多。本研究構建的重組腺病毒Ad-GFP-C197能在細胞內高效表達hTERT C末端完整的197個氨基酸。在表達載體的設計上，我們在C197片段的N端加上了6個His標簽，不但有利于檢測C197的表達，而且便于后續的蛋白純化，使得我們很方便就能得到足量的hTERT C末端片段，為進一步研究其功能打下基礎。

PAdEasy一l腺病毒載體是一種El區和E3區雙缺失的復制缺陷型載體，要得到感染性病毒則需要在含有El區的HEK293細胞內包裝復制[21]該載體通過在細胞內復制可大大增加治療基因的拷貝數，使治療基因高水平表達[22]，而且該載體安全，不會整合到宿主細胞內，因此是應用于臨床的一種基因治療載體。如Ad-p53重組腺病毒注射液（今又生）應用于臨床治療腫瘤已數年，并取得了較好的療效[23]。在實驗中，我們發現將重組腺病毒Ad-GFP-C197感染Hela細胞后，能夠明顯誘導細胞凋亡并抑制其增殖，同時還能夠降低端粒酶活性，顯示Ad-GFP-C197可能具有作為腫瘤基因治療手段的潛力，也為進一步的機制研究奠定基礎。

端粒酶活性抑制能縮短端粒，但端粒酶活性抑制至端粒縮短到臨界值至少需要20 d以上[24]。而Ad-GFP-C197感染Hela細胞后3d即出現明顯抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，表明其作用機制可能不只是通過作用于端粒，還可能通過端粒外作用介導。已有的研究表明，NF-KB通路在腫瘤發生發展過程中起著重要的作用[25，26]。hTERT在細胞核中，可以結合到NF-KB通路靶基因的啟動子上，增強其轉錄和表達，促進腫瘤的生長[27]。已知hTERT C端含有14-3-3蛋白的結合位點，而14-3-3在端粒酶的核定位中發揮重要作用[28]。C197為完整的hTERT C端序列，我們推測C197在細胞內大量表達后，可能結合了大部分的14—3-3，進而抑制細胞內hTERT的核定位，使得NF-KB通路的活性受到抑制，進而抑制Hela細胞的增殖。相關的研究工作正在開展之中。