粒—巨噬細胞集落刺激因子對化療后大鼠結腸吻合口愈合的影響

摘 要：目的：探討粒-巨噬細胞集落刺激因子對化療后大鼠結腸吻合口愈合的影響情況。方法：28只Wistar大鼠實施結腸吻合術，術后隨機分草酸鉑組（A組）和草酸鉑+GM-CSF組（B組），每組14只，B組于吻合口兩側漿膜下層注射GM-CSF。術后24小時兩組腹腔注射草酸鉑25mg/kg。測定吻合口爆破壓、羥脯氨酸含量及膠原纖維含量。結果術后第7天二組均出現吻合口漏，分別為3例和2例，差異無統(tǒng)計學意義；二組爆破壓值及羥脯氨酸含量分別為：（169.26±4.31）mmHg、（191.15±1.84）mmHg；（9.86±0.40）μg/mg、（11.38±0.50）μg/mg；Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量分別為：（1.08±0.11）p·μm2、（1.43±0.08）p·μm2；（1.06±0.10）p·μm2、（1.34±0.09）p·μm2。A組與B組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：局部注射GM-CSF可促進結腸吻合口愈合。

關鍵詞：粒-巨噬細胞集落刺激因子； 藥物療法； 傷口愈合

中圖分類號：TQ464 文獻標識碼：A 文章編號：1006-3315（2015）01-178-002

中晚期結直腸癌術后易出現轉移，預后效果不佳，因此，大腸癌術后輔助治療受到國內外學者的重視。手術聯(lián)合術后早期腹腔化療可顯著提高大腸癌患者無病生存期與5年生存率[1]，但化療藥物可延緩消化道吻合口的愈合[2-4]，本文以Wistar 大鼠為實驗模型，探討粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）對化療后大鼠結腸吻合口愈合的影響情況，從而為臨床應用提供必要的實驗依據。

一、材料與方法

1.材料

草酸鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司）。GM-CSF（廈門特寶生物工程有限公司）。羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維試劑盒（北京中杉金橋生物工程有限公司）。

2.實驗分組

清潔級Wistar大鼠28只，隨機分二組：A組：結腸吻合術+術后腹腔注射草酸鉑；B組：結腸吻合術+術中局部注射GM-CSF+術后腹腔注射草酸鉑。

3.動物模型的建立

Wistar大鼠術前禁食12h，2.5%戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉。麻醉成功后四肢固定，常規(guī)進腹，行結腸斷端吻合術。

4.給藥方式

草酸鉑溶于5%葡萄糖溶液50ml中，終濃度為1mg/ml，于術后24h按25mg/kg腹腔注射；B組術中結腸吻合完成后，在吻合口兩側漿膜下層用21G注射器注射GM-CSF50μg。

5.吻合口爆破壓測定

移出以吻合口為中心長約6cm腸管，遠端固定于壓力傳感器（YH-4，北京航天醫(yī)學工程研究所），近端連接注射泵（WZ-50C66 浙江大學醫(yī)學儀器有限公司），以2ml/min速率注入生理鹽水，記錄壓力曲線突然降低時的數值為腸吻合口爆破壓值。

6.羥脯氨酸含量的測定

取0.5cm×0.5cm大小的吻合口組織保存于-80℃深低溫冰箱，按羥脯氨酸測定試劑盒說明檢測。

7.膠原纖維含量測定

免疫組化染色過程按試劑盒說明進行，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維染成棕黃色顆粒或片狀。由德國萊卡Q550IW圖像分析儀進行計算機圖像分析，結果取像素（pixels，p）和面積（μm2）平均值的乘積。

8.統(tǒng)計學分析

實驗數據以均數±標準差（±s）表示，資料統(tǒng)計采用統(tǒng)計學軟件SASFor Windows6.12分析，采用單因素方差分析、SNK-q檢驗和χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結果

1.大體形態(tài)的觀察

術后各組大鼠無一例死亡，第7天均再次接受腹腔麻醉，剖腹探查，觀察有無吻合口漏發(fā)生。吻合口漏出現情況：A組3例，B組2例，差異無統(tǒng)計學意義。

2.爆破壓測定結果（表1）

術后第7天，A、B組之間平均爆破壓差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示局部注射GM-CSF可能促進化療后大腸吻合口愈合。

3.羥脯氨酸含量測定結果（表1）

A組羥脯氨酸含量低，與B兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0001）。

4.膠原纖維含量測定結果

免疫定量顯示Ⅰ型膠原纖維分別為（1.08±0.11）p·μm2、（1.43 ±0.08）p·μm2；Ⅲ型膠原纖維分別為（1.06±0.10）p·μm2、（1.34±0.09）p·μm2。A組Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量低于B組（P<0.01）。

三、討論

結直腸癌術后復發(fā)及轉移是患者預后不良的重要因素，所以術后輔助治療已得到認可。術后腹腔化療可使化療藥物與腹膜表面充分接觸，直接殺滅瘤細胞，對預防復發(fā)和腹膜種植有獨特的優(yōu)勢。時機傾向于手術切除原發(fā)腫瘤后24h開始[5-6]，Pestieau等[7]實驗結果表明，草酸鉑腹腔化療對消除結直腸癌術后的微觀轉移灶有良好的效果。

國外學者主張采用[8]：（1）爆破壓；（2）羥脯氨酸含量；（3）膠原纖維含量作為衡量胃腸吻合口愈合情況的指標。膠原纖維組織是維持胃腸吻合口張力的主要因素，位于胃腸黏膜下層，生物化學分析顯示Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量占總膠原纖維的88%[9]。多項研究表明：吻合口愈合主要依賴于膠原纖維合成的總量、速率及成熟度[10]。研究表明，局部注射GM-CSF能促進術中放射治療條件下結腸吻合口的愈合，其機制可能為[11-12]：動員吻合口周圍組織單核細胞、淋巴細胞及巨噬細胞分化及遷移，巨噬細胞可釋放一系列的細胞活素、生長因子，促進成纖維細胞的分裂與增殖，加快膠原纖維合成，改善創(chuàng)面微循環(huán)，提供組織修復所必需的氧和營養(yǎng)物質。本實驗B組爆破壓、羥脯氨酸含量及膠原纖維含量均高于A組，組間比較差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示局部注射GM-CSF可促進術后腹腔化療條件下結腸吻合口的愈合。但局部注射GM-CSF是否涉及血液系統(tǒng)改變及對機體的影響仍不明確，需進一步研究證實。

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