油封M2與M16培養液及二甲基亞砜對小鼠雙線期阻滯釋放期間卵母細胞的影響

李漢文，劉玲玲，李亙松，朱鑠同，李春雨，鄧欣

（中國醫科大學 1. 附屬第四醫院肛腸外科，沈陽 110032；2. 基礎醫學院生理學教研室，沈陽 110122；3. 附屬第四醫院中心實驗室，沈陽110032）

未成熟卵細胞的體外成熟培養 （in vitro maturation，IVM） 技術已應用多年，但目前IVM后受精率和優質胚胎率低下，妊娠率僅為20%～30%，且流產率較高［1］。IVM的培養條件及培養環境還不夠完善，卵母細胞發展成熟機制仍在不斷探索中。小鼠卵母細胞取材的質量與數量對于更好地研究卵母細胞成熟機制非常重要。哺乳動物卵母細胞從卵巢卵泡中釋放后，自發地恢復減數分裂。在第一次減數分裂之前，卵母細胞從萌發囊泡 （germinal vesicle，GV）到胚泡破裂 （germinal vesicle break down，GVBD） 經歷了一個漫長的過程，即雙線期阻滯釋放進程［2］。GVBD是核分離的開始，它是減數分裂過程中的第一個重要事件，也是卵母細胞成熟的標志［3］，這一階段卵母細胞培養的效果至關重要。因此，本研究擬探討油封M2液滴培養與傳統M16培養對GV期至GVBD期 （即雙線期阻滯釋放期間） 卵母細胞的形態及生存率的影響。

二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO） 是一種雙極性溶劑，為常用的藥物溶媒，具有膜親和力高的特點，可協助脂溶性藥物透過細胞膜，促進細胞對藥物的吸收利用。但DMSO具有細胞毒性，在細胞培養中超過一定劑量后會對細胞的分化、生長和凋亡產生影響［4］，控制好DMSO的濃度劑量對細胞藥物實驗結果具有重要的影響。因此，本研究擬探索不同濃度的DMSO對雙線期阻滯釋放期間卵母細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SPF級KM雌鼠，3周齡，由中國醫科大學實驗動物中心提供。M2、M16培養液、礦物質油和DMSO購自中國上海Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠卵母細胞的分離：頸椎脫臼法處死雌鼠。取出卵巢，用2個1 mL注射器在M2培養液中將小鼠卵巢挑破，顯微鏡下反復沖洗，游離出裸露的GV期卵母細胞。

1.2.2 培養微滴的制備：用50 μ L移液器在35 mm無菌塑料組織培養皿的底部做20個規則排列的30 μ L M16培養微滴，用于直接培養卵母細胞 （M16組） 。用同樣方法制備20滴30 μ L M16培養微滴，然后立即在培養微滴上覆蓋礦物質油，將培養皿置于37 ℃、5%CO2培養箱內過夜平衡 （油封M16組） ，次日用于培養卵母細胞［5］。用同樣方法制備20滴30 μ L M2培養微滴，立即在培養微滴上覆蓋礦物質油，用于直接培養卵母細胞 （油封M2組） 。

1.2.3 卵母細胞在不同培養微滴中的分組培養及觀察：取分離的卵母細胞，隨機分為60組，每組30個，在顯微鏡下將60組卵母細胞隨機置入3種各20滴的培養微滴中，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養4 h。顯微鏡下觀察每組卵母細胞生存率及GV期和GVBD期卵母細胞的數目和形態改變。

1.2.4 卵母細胞在不同濃度DMSO中的分組培養及觀察：取分離的卵母細胞，隨機分為30組，每組50個，在顯微鏡下將細胞隨機分入含0% （對照組）、1%和2% DMSO的M2培養微滴中 （每種濃度各10組） ，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養4 h。顯微鏡下觀察每組卵母細胞生存率及GV期和GVBD期卵母細胞的數目。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。2組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同培養基中小鼠卵母細胞的生存率

油封M2組卵母細胞的生存率 （98.65%±2%） 高于油封過夜M16液滴培養組 （90.35%±6%） ，M16直接培養存活率 （32.75%±14%） 極低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。見圖1。

2.2 不同培養基對小鼠卵母細胞GV期和GVBD期數目的影響

油封M2組與油封M16組停留在GV期的卵母細胞數 （油封M2組GV：16.10%±6%；油封M16組GV：14.40%±6%） 比較，差異無統計學意義 （P ＞ 0.05） 。見圖2。

圖2 M2與M16培養4 h小鼠卵母細胞GV期與GVBD期數量比例Fig.2 Percentage of GV and GVBD of mouse oocytes cultured in M2 and M16 after 4 h

2.3 不同培養基對小鼠卵母細胞形態的影響

如圖3所示，與油封過夜M16和單純M16液滴培養的卵母細胞相比，油封M2液滴培養的細胞形態更好更完整。

2.4 不同濃度DMSO對培養的小鼠卵母細胞存活率的影響

對照組、1%DMSO組和2%DMSO組卵母細胞在雙線期阻滯期間的存活率 （對照組：98.50%±1.7%；1%DMSO組：97.54%±1.9%；2%DMSO組：99.00%±1.0%） 無統計學差異。見圖4。

圖3 不同培養液對卵母細胞形態的影響Fig.3 Effect of different culture media on the morphology of oocytes

圖4 不同濃度DMSO對卵母細胞存活率的影響Fig.4 Survival rate of oocytes in medium with different concentrations of DMSO

2.5 不同濃度DMSO對小鼠卵母細胞雙線期阻滯釋放的影響

對照組和1%DMSO組卵母細胞培養4 h后，卵母細胞停留在GV期和GVBD期的比例無明顯差異（P ＞ 0.05） ，2%DMSO組卵母細胞停留在GV期的比例顯著降低 （對照組：11.67%±4.58%；1%DMSO組：12.46%±5.84%；2%DMSO組：2.00%±2.83%，P ＜0.01）。表明DMSO濃度達2%時對卵母細胞雙線期阻滯釋放有促進作用，而1%以下濃度的DMSO對卵母細胞雙線期阻滯釋放無顯著影響。見圖5。

3 討論

圖5 不同濃度DMSO培養小鼠卵母細胞4h GV期與GVBD期數目比例Fig.5 Percentage of GV and GVBD of mouse oocytes cultured in medium with different concentrations of DMSO

卵母細胞的成熟對哺乳動物的繁殖至關重要。然而，控制卵母細胞成熟的機制一直眾說紛紜。哺乳動物卵母細胞成熟與卵泡發育有關，同時細胞核包膜和染色體分離的調控是卵母細胞減數分裂和受精卵有絲分裂的重要事件［6-7］。卵泡顆粒細胞產生的抑制因子能夠使卵母細胞被阻滯在第一次減數分裂前期 （前期Ⅰ） ，即GV期，也稱雙線期阻滯。當卵母細胞從卵泡中釋放后，自發地恢復減數分裂［8-9］，即雙線期阻滯釋放，在第一次減數分裂之前，哺乳動物的卵母細胞從GV期發育到了GVBD期。GVBD是核分離的開始，是減數分裂過程中的第一個重要事件，也是卵母細胞成熟的標志。

本研究結果顯示，在從GV發育到GVBD期間，油封M2液滴培養的卵母細胞比油封過夜和單純M16液滴培養的卵母細胞生存率更高，細胞形態更佳。M2培養液中含有4-羥乙基哌嗪乙磺酸［4- （2-hydroxyerhyl） piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES］，該成分能夠有效維持培養液pH值，有利于所有配子和胚胎的體外操作［5］。而M16培養液中則不含有HEPES成分，缺乏維持恒定pH值的能力，因此，需要在培養前4～6 h或1 d制作并覆蓋礦物質油后放入培養箱內平衡［5］。但本研究結果顯示，油封M16液滴培養的卵母細胞的形態及存活率仍不及油封M2組。提示利用油封M2液滴短時間培養卵母細胞，不僅能節省制備培養液的時間，而且更容易獲得滿意的卵母細胞狀態和生存率，有利于提高實驗效率與實驗結果的準確可信性。

在進行藥物細胞實驗時，需要將藥物溶解后加入細胞培養基中，為了獲得準確可信的結果，必須盡量減少溶媒本身對細胞的影響。DMSO是一種常用的藥物溶媒，研究發現，DMSO對某些癌細胞的生長具有劑量依賴性和時間依賴性影響，不同種類的癌細胞對DMSO的耐受劑量亦不同［4，9］。本研究結果顯示，1%和2%濃度的DMSO不會影響培養卵母細胞的生存率，但是2%濃度的DMSO能更有效地促進卵母細胞雙線期阻滯的釋放，因此，在進行卵母細胞發展成熟進程的實驗中，應合理控制DMSO的濃度，以確保實驗結果的準確性和可信性。