津力達(dá)顆粒對(duì)糖負(fù)荷小鼠血糖及相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用

唐艷閣，王敬，楊家祥

（河北省中醫(yī)院 1. 內(nèi)分泌科；2. 骨傷二科，石家莊 050000）

傳統(tǒng)的中醫(yī)理論中，DM的產(chǎn)生與脾的運(yùn)化功能失調(diào)有關(guān)。津力達(dá)顆粒是一種中藥降糖藥物，它以人參、地黃、黃連和葛根作為主要成分，通過生津運(yùn)脾、益氣養(yǎng)陰改善胰島功能，目前在臨床上對(duì)DM的治療有一定效果。研究［3-5］認(rèn)為，津力達(dá)顆粒可以促進(jìn)胰島素分泌，改善胰島素抵抗，保護(hù)胰島β細(xì)胞。本研究擬觀察津力達(dá)顆粒對(duì)糖負(fù)荷小鼠血糖、體質(zhì)量、血脂、脂質(zhì)過氧化能力、肝腎損傷以及胰腺組織內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κ B （nuclear factor-kappa B，NF-κ B）及其下游炎性細(xì)胞因子的影響，旨在明確津力達(dá)顆粒對(duì)DM的防治機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠36只，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。體質(zhì)量22～28 g，于25 ℃、50%空氣濕度條件下飼養(yǎng)。本研究獲得我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：津力達(dá)顆粒干粉 （石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司） ，戊巴比妥鈉 （上海西唐生物公司） ，阿卡波糖 （拜耳醫(yī)藥保健有限公司） ，蔗糖、可溶性淀粉 （國藥制藥） ，丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 試劑盒、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 試劑盒 （南京建成生物工程研究所） 。NF-κ B、白細(xì)胞介素-1 β （interleukin-1 β，IL-1 β） 、白細(xì)胞介素-6 （interleukin-6，IL-6） 、GAPDH抗體 （美國Santa cruze公司）、二抗 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司） 。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將正常昆明小鼠36只隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為陽性對(duì)照組 （阿卡波糖10 mg/kg灌胃） 、實(shí)驗(yàn)組 （津力達(dá)顆粒75 mg/kg灌胃） 和空白對(duì)照組 （生理鹽水0.2 mL/10 g灌胃）［5］。

1.2.2 單次灌胃采血方法：小鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。禁食16 h后，從小鼠尾尖取血，測(cè)量血糖作為0 min血糖值。取血后立即給予蔗糖溶液 （2 g/kg） 或淀粉溶液 （2 g/kg） 灌胃，灌胃后給予不同藥物 （阿卡波糖/津力達(dá)顆粒/生理鹽水） ，分別于30、60、120 min后測(cè)血糖。

1.2.3 連續(xù)灌胃采血方法：給予小鼠阿卡波糖/津力達(dá)顆粒/生理鹽水連續(xù)灌胃10 d。禁食16 h后，從小鼠尾尖取血，測(cè)量血糖作為0 min血糖值。取血后立即灌胃蔗糖溶液 （2 g/kg） 或淀粉溶液 （2 g/kg） 及不同藥物，分別于30 、60、120 min后測(cè)血糖。

1.2.4 連續(xù)灌胃小鼠肝臟SOD、MDA活力測(cè)定：給予小鼠阿卡波糖/津力達(dá)顆粒/生理鹽水連續(xù)灌胃10 d后，頸椎脫位法處死小鼠，迅速取出肝臟，用生理鹽水洗凈，取0.5 g肝臟勻漿，離心后取上清按照試劑盒說明書操作，分別在650 nm或532 nm波長下測(cè)定吸光度，計(jì)算SOD或MDA活力。

1.2.5 連續(xù)灌胃小鼠體質(zhì)量的測(cè)定：小鼠連續(xù)灌胃前及灌胃不同藥物10 d后，空腹稱體質(zhì)量并記錄。

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1.2.6 連續(xù)灌胃小鼠血清生化學(xué)指標(biāo)測(cè)定：小鼠連續(xù)灌胃前及灌胃不同藥物10 d后，頸椎脫位法處死，取血1 mL，靜置3 h后，3 000 r/min離心5 min，取上清，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)甘油三酯 （triglyceride，TG） 、總膽固醇 （total cholesterol，TC） 、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C） 和 低 密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein cholesterol，LDL-C） 、尿素氮 （urea nitrogen，BUN） 、肌酐 （creatinine，Cr） 、總蛋白 （total protein，TP） 、白蛋白 （albumin，ALB） 、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （aspartate aminotransferase，AST） 、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （alanine aminotransferase，ALT） 和乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH） 。

1.2.7 Western blotting：3組小鼠藥物連續(xù)灌胃10 d后，頸椎脫位法處死，迅速取出胰腺組織，用生理鹽水洗凈，取胰腺組織用RIPA裂解勻漿，提取蛋白，通過G250定量，取30 μ g蛋白進(jìn)行電泳 （80～120 V） 、轉(zhuǎn)膜 （100 V，1 h） 后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗 （NF-κ B 1∶300，IL-1 β 1∶300，IL-6 1∶300，GAPDH 1∶500） ，4 ℃過夜，TBST清洗3次。加入山羊抗兔二抗 （1∶5 000） ，室溫孵育1 h后，TBST清洗3次。ECL發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組數(shù)據(jù)。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物灌胃對(duì)蔗糖/淀粉負(fù)荷小鼠血糖的影響

分別于蔗糖或淀粉負(fù)荷后0、30、60和120 min測(cè)量3組小鼠血糖值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，津力達(dá)顆粒灌胃1次后30 min即可降低蔗糖或淀粉負(fù)荷小鼠的血糖水平（P = 0.047，P = 0.028） ，60 min時(shí)津力達(dá)顆粒對(duì)血糖的抑制依然明顯 （P = 0.032，P = 0.019） ，120 min時(shí)實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組及空白對(duì)照組血糖水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示津力達(dá)顆粒能顯著降低餐后2 h內(nèi)血糖。連續(xù)灌胃津力達(dá)顆粒10 d對(duì)蔗糖或淀粉負(fù)荷小鼠血糖的抑制作用更為顯著，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （30 min：P = 0.002，P = 0.009；60 min：P = 0.002，P = 0.006） ，見圖1。

2.2 不同藥物灌胃對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

圖1 津力達(dá)顆粒對(duì)小鼠血糖的影響Fig.1 Effect of Jinlida granules on blood glucose of mice

連續(xù)灌胃10 d后，各組小鼠體質(zhì)量均隨時(shí)間推移穩(wěn)步上升，但灌胃后3組小鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 3組小鼠灌胃前后體質(zhì)量比較 （g）Tab.1 Comparison of mice body weight before and after gastric lavage in 3 groups （g）

2.3 不同藥物灌胃對(duì)小鼠肝臟SOD和MDA的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，藥物灌胃10 d后，津力達(dá)顆粒可以顯著提高小鼠肝臟內(nèi)SOD活力 （P = 0.003） ，降低MDA含量 （P = 0.006） ，見表2。

2.4 不同藥物灌胃對(duì)血清生化學(xué)指標(biāo)的影響

血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平是反映血脂的重要指標(biāo)，連續(xù)灌胃津力達(dá)顆粒10 d后，血清TG水平顯著降低，TC、HDL-C和LDL-C改變不明顯。BUN和Cr是反映腎功能的重要指標(biāo)，藥物對(duì)腎臟無不良影響是藥物安全使用的前提，本研究中給予小鼠津力達(dá)顆粒灌胃后，BUN和Cr與對(duì)照組相比未見顯著變化，提示未對(duì)腎臟造成不良影響。通過檢測(cè)津力達(dá)顆粒對(duì)血清TP和ALB水平的影響發(fā)現(xiàn)，津力達(dá)顆粒幾乎不影響血清內(nèi)的蛋白水平。AST及ALT/AST檢測(cè)結(jié)果顯示，津力達(dá)顆粒并不影響小鼠ALT/AST值，提示未造成肝臟損傷。本研究結(jié)果還顯示，連續(xù)灌胃津力達(dá)顆粒及阿卡波糖均可顯著下調(diào)小鼠血清LDH水平 （P = 0.032/P = 0.019） ，說明二者對(duì)小鼠的心肌細(xì)胞均有一定的保護(hù)作用。見表3。

表2 不同藥物灌胃對(duì)小鼠SOD和MDA的影響Tab.2 Effect of gastric lavage with different drugs on SOD and MDA of mice

2.5 不同藥物灌胃對(duì)炎性細(xì)胞因子的影響

NF-κ B可以通過調(diào)節(jié)下游炎癥通路影響DM的進(jìn)程，Western blotting結(jié)果顯示，津力達(dá)顆粒可以在一定程度上抑制胰島中NF-κ B及其下游IL-1 β和IL-6的表達(dá)，見圖2。

表3 不同藥物灌胃對(duì)小鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響Tab.3 Effect of gastric lavage with different drugs on the serum indexes of mice

3 討論

DM是一種以長期慢性高血糖為主要特征的多因素誘導(dǎo)的代謝性疾病，通常是由于胰島素分泌不足、糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝紊亂所致［6］。降低血糖能夠預(yù)防DM的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，不論是單次還是連續(xù)多次津力達(dá)顆粒灌胃，均能夠在不影響體質(zhì)量的前提下下調(diào)餐后2 h血糖，效果與阿卡波糖作用相近，且不會(huì)影響長期血糖的自我調(diào)節(jié)作用，對(duì)于DM的預(yù)防有一定作用。

圖2 津力達(dá)顆粒對(duì)NF-κ B等炎性細(xì)胞因子的影響Fig.2 Effect of Jinlida granules on inflammatory cytokines

血清TG是反映血脂的主要指標(biāo)［7］，津力達(dá)顆粒連續(xù)灌胃能夠降低血清內(nèi)TG的含量，但是對(duì)TC和HDL-C等指標(biāo)影響不明顯，說明津力達(dá)顆粒能夠調(diào)節(jié)血脂的水平，作用類似于阿卡波糖，但由于本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為正常小鼠，故對(duì)反映血脂的其他指標(biāo)的抑制并不明顯。

氧化應(yīng)激是自由基促氧化與機(jī)體抗氧化失衡造成的，與多種生理及病理過程密切相關(guān)。有報(bào)道指出，DM的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)自由基的增多及抗氧化防御系統(tǒng)功能的紊亂密切相關(guān)，氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致DM并發(fā)癥的產(chǎn)生。SOD能夠清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，對(duì)維持機(jī)體氧化平衡起重要作用。機(jī)體通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，攻擊生物膜中的多種不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成MDA等脂質(zhì)過氧化物，因此，這些脂質(zhì)過氧化物可以間接地反映細(xì)胞損傷的程度［8-9］。本研究中檢測(cè)了津力達(dá)顆粒連續(xù)灌胃對(duì)小鼠SOD和MDA的影響，結(jié)果顯示，津力達(dá)顆粒與阿卡波糖相近，均可顯著降低小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平。

血清中的BUN主要經(jīng)腎小球?yàn)V過，并隨尿液排出體外。當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受損害時(shí)，腎小球?yàn)V過率降低，血液中BUN的濃度就會(huì)增加。Cr可作為內(nèi)生肌酐清除率的必需指標(biāo)用于評(píng)價(jià)腎臟功能，可以預(yù)測(cè)DM腎病的進(jìn)展。蛋白質(zhì)能夠維持血液膠體滲透壓，也與機(jī)體的免疫功能相關(guān)，測(cè)定血清中TP和ALB的含量可以了解機(jī)體的營養(yǎng)狀況和免疫情況。血清中ALT和AST是反映肝細(xì)胞損害的最直接血清指標(biāo)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)津力達(dá)顆粒幾乎不會(huì)造成小鼠的肝腎損傷，且對(duì)正常小鼠血清蛋白水平無顯著影響。

LDH作為一種糖酵解酶，可以衡量機(jī)體的無氧代謝能力，當(dāng)肌肉組織受到損害時(shí)，由于缺氧，代謝產(chǎn)物堆積，自由基增加，可導(dǎo)致細(xì)胞膜受損通透性增加，血清內(nèi)LDH濃度上升。血清內(nèi)LDH水平可以提示肌細(xì)胞是否受損，也能反映機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)津力達(dá)顆粒能夠下調(diào)血清內(nèi)LDH水平，提示其對(duì)肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

NF-κ B活化可以促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子的釋放，造成組織細(xì)胞損傷，還可以增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)，增加一氧化氮合成，損傷胰島β細(xì)胞，加速DM的進(jìn)程［13］。IL-1 β和IL-6作為反映炎癥的主要因子，通常在DM患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，津力達(dá)顆粒能夠在一定程度上抑制NF-κ B及IL-1 β和IL-6的表達(dá)，抑制作用接近阿卡波糖，提示津力達(dá)顆粒能夠減少組織細(xì)胞的損傷，抑制炎癥的發(fā)生，減緩DM的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，津力達(dá)顆粒能夠在維持小鼠體質(zhì)量、不損傷肝腎功能的前提下，降低餐后血糖濃度，抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)于DM的預(yù)防具有積極的意義。