血清白細胞介素-6和白細胞介素-1 β水平在預測依那西普治療類風濕關節炎患者臨床應答中的作用

姜薇，王娟

（江漢大學附屬醫院 1. 風濕血液內科；2. 內分泌科，武漢 430015）

類風濕關節炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是一種以滑膜組織炎癥為特征，以慢性多發性關節炎為主要臨床表現的系統性自身免疫性疾病［1］。如未能及時治療，2年致殘率可達50%，這不僅嚴重影響患者的生活質量，同時也給社會帶來極大的負擔［2］。腫瘤壞死因子抑制劑 （tumor necrosis factor inhibitor，TNFi） 是一類可以特異性拮抗腫瘤壞死因子-α （tumor nectorsis factor α，TNF-α） 的生物制劑，主要包含依那西普 （etanercept，ETN） 、英夫利昔 （infliximab，IFX） 和阿達木單抗 （adalimumab，ADA） ，常用于RA的治療。臨床數據表明，雖然TNFi的使用極大地提高了RA患者治療轉歸，然而，依然有20%～30%的RA患者對于TNFi治療應答不佳或者難以承受其高昂的價格［3］。因此，積極探尋影響TNFi治療RA患者療效預測因素，從而進一步促進患者的個體化治療亟待進行。本研究通過檢測基線期血清中8個與炎癥調節相關蛋白的表達水平，旨在評估其在預測ETN治療RA患者臨床應答中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性隊列研究。研究連續納入58例2015年1月至2016年12月于江漢大學附屬醫院就診的活動性RA患者。入組標準為：（1） 符合1987年美國風濕病學會 （American College of Rheumatology，ACR） 的RA分類標準或2010年修訂的ACR/歐洲抗風濕病聯盟 （European League Against Rheumatism，EULAR） 的RA分類標準［4］； （2） 年齡≥18周歲； （3）28關節疾病活動度 （disease activity score 28，DAS28） ＞3.2分［5］； （4） 準備接受ETN治療； （5） 研究者判斷可定期隨訪的患者。排除標準為：（1） 6個月內使用過TNFi治療的患者； （2） 正處于全身急、慢性感染期間，或既往有活動性結核史者； （3） 合并乙肝表面抗原陽性，或丙肝抗體陽性； （4） 合并中重度肝功能異?；蚰I功能異常； （5） 惡性腫瘤史患者； （6） 中重度心力衰竭史患者 （紐約心臟學會3～4級） ； （7） 孕婦、哺乳期婦女或準備懷孕的婦女； （8） 認知功能障礙等導致無法正常進行問卷評估的患者。本研究已獲得江漢大學附屬醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 研究流程

本隊列研究不干預患者用藥方案，患者根據疾病需要和個人意愿選擇ETN進行RA的治療持續6個月。ETN的使用參考2010年中華醫學會風濕病學分會《風濕病學診斷和治療指南》以及《依那西普治療類風濕關節炎和強直性脊柱炎的專家建議》推薦，并結合臨床實際情況進行治療。ETN常規用法用量為25 mg/次、每周2次或50 mg/次、每周1次，皮下注射。根據患者病情需要，常加用一種緩解疾病抗風濕類藥物 （disease-modifying antirheumatic drugs，DMARD） 進行聯合治療，包含甲氨蝶呤 （methotrexate，MTX） 、來氟米特 （leflunomide，LEF） 和柳氮磺胺吡啶 （salazosulfadimidine，SSZ） 。58例患者中，由于療效不佳，1例于第3月、2例于第5月分別提前退出研究，2例由于肝功能持續升高，于第3月、第4月分別提前退出研究。研究采用意向分析，即提前退出研究的患者按照最后一次隨訪的數據作為最后研究重點數據進行分析。

1.3 臨床信息采集

收集基線期患者年齡、性別、病程、生化指標、疾病評估指標以及合并用藥等信息。計算患者每次隨訪以及終點第6個月時DAS28評分。采用EULAR定義的TNFi治療RA臨床應答標準［6］進行療效評估，即臨床應答定義為經過TNFi治療后DAS28評分相對于基線期下降≥1.2分。

1.4 樣本采集及ELISA檢測

所有患者于基線期清晨空腹采集外周血4 mL，進行離心分離，并將血清置于-80℃保存備用。采用酶聯免疫吸附測定 （enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA） 試劑盒檢測血清中TNF-α （美國Invitrogen公司） 、白細胞介素 （interleukin，IL） -1 β （美國Invitrogen公司） 、IL-6 （美國Invitrogen公司） 、IL-17A （美國Invitrogen公司） 、IL-21 （美國Invitrogen公司） 、IL-34（英國Cambridge公司） 、核因子κ B受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）（英國Cambridge公司） 和軟骨寡聚基質蛋白 （cartilage oligomeric matrix protein，COMP） （美國R&D公司） 表達水平，所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.5 統計學分析

本研究使用SPSS 22.0軟件和GraphPad prism 5.01軟件進行統計分析。數據采用x-±s、中位數 （四分位間距） 或頻次 （百分比） 進行描述。采用Wilcoxon秩和檢驗對ETN治療應答組與無應答組基線期血清標志物表達水平差異進行比較分析。利用受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線及曲線下面積 （area under curve，AUC） 評估差異表達血清標志物對ETN治療RA臨床應答的預測作用。采用單元和多元logistic回歸模型分析影響ETN治療RA患者臨床應答的因素。P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基線信息

本研究連續納入的58例RA患者平均年齡為（49.5±10.7） 歲，其中，男17例，女41例，病程中位值為61 （45～72） 個月。RA患者DAS28評分和健康善評定表（health assessment questionnaire，HAQ）評分的均值分別為5.6±1.6和1.8±0.7，46例 （79.3%） 類風濕因子 （rheumatoid factors，RF） 呈陽性，39 （67.2%）例抗環瓜氨酸肽抗體 （anti-cyclic citrullinated peptides，Anti-CCP） 呈陽性。見表1。

表1 RA患者基線信息Tab.1 Baseline characteristics of RA patients

2.2 ETN治療應答組與無應答組基線血清標志物表達水平

經6個月ETN治療后，38例RA患者DAS28評分相對于基線期下降≥1.2，符合臨床應答標準，劃入應答組，其余20例未達到臨床應答，劃入無應答組。應答組患者基線期IL-1 β （P = 0.011） 和 IL-6 （P = 0.004）水平顯著高于無應答組，但2組基線TNF-α （P =0.229） 、IL-17A （P = 0.134） 、IL-21 （P = 0.182） 、IL-34（P = 0.143） 、RANKL （P = 0.909） 和COMP （P = 0.284）水平均無統計學差異。見圖1。

2.3 血清標志物在預測ETN治療臨床應答的ROC曲線

采用ROC曲線評估差異表達血清標志物IL-1 β和IL-6對ETN治療RA患者臨床應答的預測作用，基線期血清IL-1 β和IL-6水平均具有較好的區分臨床應答和無應答患者的能力，AUC分別為 0.703（95% CI：0.558～0.847） 和0.732（95% CI：0.601～0.862）。見圖2。

2.4 基線期預測ETN治療RA患者臨床應答的因素分析

進一步采用單元、多元邏輯回歸模型分析基線期特征對ETN治療RA患者臨床應答的預測作用，其中連續變量以中位值為切割點劃分高低進行分析。單元邏輯回歸結果表明 （表2） ，基線期IL-6高表達（P = 0.031） 和CRP高表達 （P = 0.008） 均可以預測ETN治療RA患者具有較好的臨床應答。將單元回歸模型中P ＜ 0.1的因素進一步納入多元回歸模型分析，結果顯示，基線期IL-6 （P = 0.031） 和CRP （P =0.012） 高表達均可以獨立預測ETN治療RA患者更好的臨床應答。提示IL-6高表達可以獨立于CRP預測ETN治療RA患者臨床應答，見表3。

3 討論

目前研究［7］表明，IL-1 β可以促進RA滑膜細胞和淋巴細胞的增殖和分化，促進滑膜細胞和軟骨細胞合成并釋放前列腺素E2和膠原酶，從而引發滑膜的炎癥反應和軟骨機制的崩解，造成關節損傷，同時局部免疫復合物、游離的膠原等分解產物反過來也可以刺激IL-1 β的合成，從而形成一個惡性循環，促進RA的發展。既往研究［8-9］表明，RA患者的血清IL-1 β水平顯著高于正常人群，并且與RA患者疾病活動度正相關。然而，IL-1 β是否可以預測TNFi治療RA患者臨床療效尚有爭論。一項瑞典和日本聯合進行的隊列研究［10］表明，血漿中IL-1 β高水平可以預測患者使用TNFi治療獲得臨床應答。然而荷蘭一項隊列研究［11］卻發現，滑膜中IL-1 β表達水平與TNFi治療RA患者的臨床應答無關聯。目前IL-1 β在TNFi治療中國RA患者療效預測作用研究尚未見報道，本研究發現血清IL-1 β水平在TNFi治療應答組RA患者中高于無應答組患者，并且ROC曲線表明IL-1 β水平具有不錯的區分應答組與無應答組患者的能力。這可能是由于IL-1 β與患者的炎癥水平正相關，而高炎癥水平患者對于TNFi的強力抗炎作用應答更加明顯，也具有更大的DAS28下降閾值。

圖1 ETN治療應答組與無應答組基線血清標志物表達水平的差異Fig.1 Differences in expression of serum baseline markers between ETN-responser and non-responser groups

圖2 血清標志物對ETN治療應答的ROC曲線

IL-6是一種多效性前炎性細胞因子，是造成RA的主要病因之一［12］。既往研究［13］表明，IL-6表達水平在RA患者的關節滑膜、滑膜液和外周血中均顯著增加，提示IL-6水平或許可作為RA患者疾病嚴重程度評估的標記物以及成為RA治療靶標的潛能。近期IL-6抑制劑 （托珠單抗） 的問世及廣泛應用進一步驗證了此觀點［14］。然而，目前關于IL-6表達水平對于TNFi治療RA患者臨床療效的影響少有報告。一項日本的隊列研究［15］顯示，基線期血清IL-6水平可能會預測早期RA患者的骨破壞進展。此外，瑞典和日本聯合進行的隊列研究［10］表明，血漿中IL-6高水平可以預測患者使用TNFi治療獲得臨床應答。目前IL-6在TNFi治療中國RA患者療效預測作用研究尚少，本研究發現基線期血清IL-6水平在ETN治療應答組中顯著高于無應答組，ROC曲線分析表明，IL-6水平具有不錯的區分應答組與無應答組患者的能力。并且，單元多元邏輯回歸分析證明，基線期IL-6高水平是ETN治療RA患者臨床應答的獨立預測因素。可能原因為：（1） IL-6高水平與患者炎癥高水平相關，而高炎癥水平患者對于TNFi治療的抑制炎癥作用應答更加明顯，其也具有更大的DAS28下降閾值； （2）IL-6高水平可以激活NF κ B和Wnt等促炎信號通路，進而提高患者對于TNFi治療的應答。

表2 影響ETN治療RA患者臨床應答因素的單元邏輯回歸分析Tab.2 Univariate logistic regression analysis of clinical response factors affecting RA patients on ETN

表3 影響ETN治療RA患者臨床應答因素的多元logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of clinical response factors affecting RA patients on ETN

本研究存在一些不足：（1） 本研究納入的患者樣本量較少，因此可能導致部分分析缺乏統計效能。 （2） 本研究隨訪時間較短，因此，ETN治療RA患者長期療效的預測因素未能評估。 （3） RA患者在接受ETN治療時，有聯合使用MTX、LEF和SSZ，這些混雜因素可能對結果產生干擾，但本研究采用單元、多元邏輯回歸分析，減少了這些混雜因素對于結果的影響。

綜上所述，本研究表明，基線期血清IL-1 β和IL-6表達水平可能會作為ETN治療RA患者臨床應答的生物標記物。