紅菇多糖體外抗氧化作用研究

【摘 要】為了進一步開發(fā)利用紅菇資源，筆者研究了紅菇多糖對DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基的清除能力。結果表明：紅菇多糖對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基都具有較強清除作用，并呈一定的量效關系，表明紅菇多糖具有良好的抗氧化作用。

【關鍵詞】紅菇多糖 " " 抗氧化 " " "DPPH自由基 " " 羥基自因基 " " 超氧陰離子自由基

紅菇（Russula lutacea F r.） 屬真菌植物門，擔子菌亞門、擔子綱、紅菇目、紅菇科，乳菇屬。目前已發(fā)現(xiàn)的紅菇屬真菌種類至少在750種以上，其中我國有150多種，紅菇子實體提取物具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、抗疲勞、降血脂、降血糖等多種藥理活性，是不可多得的純天然的保健食用菌，紅菇不但具有良好的藥用效果，而且不會對機體產生毒副作用。

多糖類化合物對自由基具有良好清除作用，而現(xiàn)代醫(yī)學研究表明機體的衰老、細胞癌變以及免疫性疾病等等都和機體中自由基代謝有直接關系，因此，對清除自由基的研究已經受到越來越多研究者的關注。本實驗利用超聲波輔助提取紅菇多糖，研究其清除自由基的抗氧化活性，為進一步開發(fā)紅菇資源打下良好基礎。

1 材料與儀器

1.1實驗材料

野生紅菇：購自廣西容縣。紅菇多糖：超聲輔助水提經savage法脫蛋白所得脫蛋白紅菇多糖。1，1 -二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氯仿、水楊酸、乙醇、正丁醇、H2O2.抗壞血酸（ VC）、甲醇等均為分析純。雙蒸水為實驗室自制。

1.2主要儀器

搖擺式高速萬能粉碎機（DFY-250）;電子天平BS323S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華）;TU一1900雙光束紫外可見分光光度計 （北京普析）;超聲波清洗儀KQ5200M（東莞市科橋超聲波設備有限公司）; LGJ-冷凍干燥機;離心機（上海安亭）

2 實驗方法

2.1紅菇子實體的預處理

先將紅菇子實體烘干粉碎后，過60目篩，得紅菇干粉，稱取紅菇干粉200g，加入1000ml圓底燒瓶中，按液料比3∶1（ml/g），加入80%乙醇80℃熱水恒溫回流2次，每次60min，再抽濾除去脂肪，單糖、低聚糖等雜質，放到烘箱中低溫烘干備用。

2.2 紅菇多糖的提取

準確稱取50g預處理紅菇干粉，按一定料水比置于1000 mL錐形瓶中，超聲波清洗器中超聲提取，將提取液過濾，濾液濃縮1/3，經過Sevage法脫蛋白法反復處理3次直至無明顯沉淀，然后加入3倍體積的95%乙醇，置4℃冰箱過夜，4000r/min 離心10 min，收集沉淀，放入冷凍干燥機冷凍干燥，得紅菇多糖粉末。取提取液適當稀釋后，硫酸苯酚法測定多糖含量。多糖得率（%）以單位質量子實體干粉提取的多糖質量表示。

2.3紅菇多糖樣品液制備

分別準確地將紅菇多糖配成濃度為1mg/ml的溶液，用蒸餾水將該溶液稀釋成濃度為：50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，以相同濃度的VC為陽性對照。

2.4紅菇多糖的體外抗氧化能力測定

2.4.1清除DPPH自由基能力測定

配置2mol/LDPPH甲醇溶液避光保存，取 0.4 ml待測樣液加入2ml2mol/L DPPH甲醇溶液具塞試管中，充分搖勻，25℃恒溫避光放置30min， 在517nm處測定吸光值Ai，每個濃度樣品平行做3次，以相同濃度VC作為陽性對照。

清除DPPH自由基活性按下列公式計算：

DPPH自由基清除率/% =[1-（Ai-Aj）/A0]×100 " " " " " " "（2-1）

式中， Ai： 2mlDPPH溶液加 0.4 ml紅菇多糖溶液的吸光值; Aj： 2ml甲醇溶液加 0.4 mL紅菇多糖溶液加的吸光值; A0： 2mlDPPH溶液加 0.4 mL蒸餾水的吸光值。

2.4.2清除羥基自由基能力測定

反應體系中加入9mol/LFeSO4 lml，9mol/L水楊酸一乙醇lml，紅菇多糖樣品溶液1ml，最后加入1ml6mol/L H2O2啟動反應，37℃反應0.5h，以蒸餾水為參比，在510nm處測定各濃度的吸光值。以1ml 9mol/LFeSO4，1ml 9mol/L水楊酸——乙醇，不同濃度的紅菇多糖溶液1ml和1ml蒸餾水作為多糖的本底吸收值，以相同濃度VC溶液作為陽性對照。

清除率計算公式：

清除率/%= "×100 " " " " " " " " " " " " " " " （2-2）

式中， A0： 空白對照液的吸光度;AX： 加入紅菇多糖溶液后的吸光度;AX0： 不加H2O2的紅菇多糖溶液本底的吸光度。

2.4.3清除超氧陰離子自由基能力測定

本試驗采取鄰苯三酚自氧化法，取50mol /LpH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 ml，加入3.2 ml蒸餾水的試管中，25℃恒溫水浴中預熱20 min，分別加入1ml不同質量濃度多糖溶液，立即加入0.3 ml25℃水浴中預熱3mol/L鄰苯三酚，混勻放置25℃水浴中精確反應4 min，立即加入8mol/L HCl終止反應，以蒸餾水替代多糖試樣溶液做空白對照試驗，以等體積10mol/LHCl代替鄰苯三酚溶液為空白調零，320nm處測定各管的吸光值，每個樣品平行做3次，以相同濃度VC作為陽性對照。

清除率（%）=（Ao-Ai）/Ao×100; " " " " " " " " " " "（2-3）

式中， "A0： 對照組吸光值; "Ai： 樣品組的吸光值。

3 結果與分析

3.1 紅菇多糖得率計算

紅菇粗多糖得率=紅菇粗多糖質量/紅菇原料干重×100%，按照上式， 200g紅菇子實體干粉共制得紅菇粗多糖干品12.64g，得率為6.32%。

3.2紅菇多糖對DPPH自由基的清除作用

紅菇多糖清除DPPH自由基作用結果見圖1。由圖1可知，隨著多糖質量濃度的增加，紅菇多糖對DPPH自由基清除能力逐漸增加，在質量濃度1000ug /ml 時，DPPH自由基清除率為78.63%。雖然其清除DPPH自由基效果稍差于VC，但是紅菇多糖仍然表現(xiàn)出較強的清除DPPH自由基能力。

圖1 nbsp;紅菇多糖對DPPH自由基的清除作用

3.3紅菇多糖對羥基自由基的清除作用

紅菇多糖對羥基自由基的清除作用結果見圖2。由圖2可知，紅菇多糖對自由基有明顯的清除作用，并且隨著多糖質量濃度的增加，紅菇多糖清除羥基能力逐漸增加，在質量濃度1000ug/mL時，羥基自由基清除率為63.54%，與紅菇多糖質量濃度表現(xiàn)出較好的量效關系，雖然其清除效果差于VC，表現(xiàn)出良好的清除羥基自由基作用。

圖2 "紅菇多糖對羥基自由基的清除作用

3.4紅菇多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

紅菇多糖對超氧陰離子自由基的清除作用結果見圖3。由圖3可知，紅菇多糖對自由基有一定的清除作用，并且隨著多糖質量濃度的增加，紅菇多糖清除超氧陰離子自由基能力逐漸增加，在質量濃度1000ug/mL時，超氧陰離子自由基清除率為45.64%，表現(xiàn)出一定的清除超氧陰離子自由基作用。

圖3 紅菇多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

4 結論

本實驗研究了紅菇多糖對清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的抗氧化作用。結果表明，紅菇多糖對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基具備較強清除能力，當多糖質量濃度為1000ug/ml時，DPPH自由基清除率為78.63%，羥基自由基清除率為63.54%，超氧陰離子自由基清除率為45.64%。提示野生紅菇潛的在應用價值，為進一步研究打下基礎。

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