小鼠胚胎顯微操作針的徒手制作及使用方法

摘要：隨著人類的進(jìn)步，越來越多的學(xué)者開始探索顯微操作領(lǐng)域，而顯微操作針是必備工具之一，顯微操作針的制作技術(shù)則顯得尤為重要。本文結(jié)合筆者實(shí)驗(yàn)摸索經(jīng)驗(yàn)，將小鼠胚胎顯微操作針的徒手制作及使用方法介紹如下，以供實(shí)驗(yàn)參考。

關(guān)鍵詞：小鼠胚胎；顯微操作針；制作及使用

隨著科學(xué)的發(fā)展，顯微操作被廣泛應(yīng)用于胞漿內(nèi)精子注射（ICSI）[1]、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[2]、克隆動(dòng)物[3]、輔助生殖技術(shù)[4]等等。本文結(jié)合筆者長期實(shí)驗(yàn)摸索經(jīng)驗(yàn)，本著既可順利完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)又可將成本降至最低的原則，現(xiàn)將小鼠胚胎顯微操作針（持卵針與注射針相結(jié)合）的徒手制作及使用方法總結(jié)如下。

1資料與方法

玻璃直形點(diǎn)滴管（上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司，中國）、酒精燈、5～10ul移液槍槍頭（北京天宇祥瑞科技有限公司，中國）、1ml注射器、一次性使用靜脈輸液針、封口膜（Parafilm M Laboratory Film）（上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司，中國）、直頭手術(shù)剪或眼科剪。

1.1顯微操作針的制作方法 準(zhǔn)備玻璃直形點(diǎn)滴管，使用前先將點(diǎn)滴管置于1mol/l的氫氟酸溶液中浸泡24h，然后用超純水（UP）連續(xù)沖洗數(shù)次，直至沖洗出來的水的PH值為中性，反復(fù)甩干多次后將玻璃直形點(diǎn)滴管置于120℃的烘箱中烘干及消毒4h，最后將其儲(chǔ)存在一個(gè)干燥密封且用75%乙醇清洗過的塑料容器內(nèi)備用。

1.2徒手拉針 于實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)上點(diǎn)燃酒精燈，戴上一次性無菌手套，選取一根準(zhǔn)備好的玻璃直形點(diǎn)滴管。雙手各持玻璃直形點(diǎn)滴管的一端，置于酒精燈上煅燒，待點(diǎn)滴管漸漸融化變軟時(shí)，雙手保持在一水平線上并同時(shí)向相反方向用力牽拉，即可徒手拉制成功顯微操作的操作針。剛拉制的操作針針尖一般過細(xì)而近似堵塞，故此時(shí)需用直頭手術(shù)剪或眼科剪將部分針尖頭剪斷，具體剪斷多少以調(diào)試可以正常使用為準(zhǔn)。

1.3顯微操作針的組裝 將徒手拉制好的操作針針尾與消毒好的5～10ul移液槍槍頭尾部相連接；打開一次性使用靜脈輸液針的包裝，剪去其針的部分而保留管的部分，再將剪的那端與上一步中的移液槍槍頭尖部相連接；再將一次性使用靜脈輸液針尾端與1ml注射器相連接，這樣就成功徒手制作出小鼠胚胎顯微操作針。

2顯微操作針的使用方法

2.1移卵操作 顯微操作針移取胚胎時(shí)，在吸入胚胎前應(yīng)先吸入少量干凈的培養(yǎng)液，再吸入少量空氣，吸微量培養(yǎng)液，后吸取胚胎，可減少拉制后點(diǎn)滴管的虹吸作用，以避免把胚胎吸入到移卵管內(nèi)而導(dǎo)致胚胎損失，這樣也有助于避免當(dāng)胚胎從移卵管打出時(shí)出現(xiàn)氣泡。當(dāng)胚胎被打入到培養(yǎng)微滴時(shí)，不要把所有的培養(yǎng)液都打出去，否則可能會(huì)在培養(yǎng)微滴中產(chǎn)生大量的氣泡，而影響胚胎的正常生長。

2.2移植操作 顯微操作針移植胚胎時(shí)，需要兩人配合操作，實(shí)驗(yàn)人員A準(zhǔn)備好需要移植的假孕雌鼠，于顯微鏡下背部開口牽扯出子宮，并在移植位點(diǎn)（采取宮管結(jié)合部下0.5cm～1cm處）用1ml注射器針頭刺孔備用；與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員B于微滴中吸取所需移植胚胎（方法同移卵操作），該過程需盡可能吸取少量液體，且避免針尖部吸入空氣，否則將在一定程度上影響胚胎正常著床率；待吸取好實(shí)驗(yàn)要求胚胎數(shù)后，B將操作針交由A控制，A將針尖插入備用好的刺孔中，注意針尖與子宮保持在一條直線上，然后囑B緩慢推動(dòng)注射器活塞，待液體全部打進(jìn)小鼠子宮后拔出操作針。此外，若推動(dòng)注射器活塞后發(fā)現(xiàn)操作針內(nèi)液體不動(dòng)，說明針尖部在小鼠子宮內(nèi)堵塞導(dǎo)致壓強(qiáng)過高，此時(shí)稍微向外抽動(dòng)針尖或調(diào)整針尖方向使針尖部壓強(qiáng)減弱即可，切忌拔出針尖重新插入，以免針尖部培養(yǎng)液外流導(dǎo)致胚胎損失。

2.3用后保存 每次使用后，需用超純水（UP）涮洗3～5遍，以洗去針尖部殘存細(xì)胞培養(yǎng)液或涮洗液，防止下次使用時(shí)堵塞針尖。涮洗后的操作針放入干燥箱干燥備用，待下次使用前20～30min取出置于超凈臺(tái)內(nèi)，用紫外線照射20min左右以保證無菌操作使用。

3討論

顯微操作針的質(zhì)量直接影響到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率[5]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，多數(shù)研究人員購買拉針儀與燒針儀來制備顯微操作的持卵針與注射針（即移卵針），無論通過何種方式，制備好的注射針都要試注射才能確定其是否適用[6]。然而，在都能適用且可順利完成實(shí)驗(yàn)的前提下，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本就顯的尤為重要。

小鼠胚胎顯微操作針的徒手制作及其使用方法簡單易學(xué)，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)操作試用，能夠順利完成課題要求任務(wù)。該方法也存在著不足。一方面，簡單的制作流程可以在短短幾分鐘內(nèi)即可制作出得心應(yīng)手的操作針，它既可以當(dāng)持卵針取胚胎亦可作為注射針進(jìn)行胚胎移植，這樣以來就為實(shí)驗(yàn)節(jié)省了大量的寶貴時(shí)間；在很大程度上節(jié)省了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的開支。另一方面，徒手制作的顯微操作針較之精密設(shè)備制成的，則顯得較為粗糙，實(shí)用性上可能也略遜一籌，在某種程度上可能會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度。

參考文獻(xiàn)：

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[4]張麗紅，王秋菊.輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)（計(jì)劃生育分冊(cè)），2004，23（1）：30-34.

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[6]NagyA，Gertsenstein M，Vintersten K，et al.Manipulatingthe Mouse Embryo：A Laboratory Manual[M].The 3th edition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2003：263-300.

編輯/申磊