23個Y—SNPs遺傳標記復合檢測體系的建立及法醫學應用研究

摘要：目的 通過建立23-plex Y-SNPs遺傳標記復合擴增檢測體系，研究該檢測體系在法醫學中的應用價值。方法 選擇Y染色體單體群命名上的23個Y-SNPs位點，建立23-plex Y-SNPs復合PCR擴增體系，利用熒光標記單堿基延伸技術和毛細管電泳檢測技術對單核苷酸多態性進行檢測，調查290名重慶地區漢族無親緣關系的男性個體。結果 23個Y-SNPs位點均具有遺傳多態性，每個位點基因的多樣性范圍為0.0137～0.4912。檢測的290名男性個體中有11種單體群、143種單倍型，其單倍型多樣性為0.9907。結論 23-plex Y-SNPs遺傳標記復合擴增檢測體系能靈敏快速準確地檢測樣本，在法醫學研究中有較高的應用價值。

關鍵詞：Y染色體；單核苷酸多態性；復合PCR擴增檢測體系；法醫學應用

Y染色體具有男性伴性遺傳特性，呈單倍型向下遺傳，在減數分裂中不發生重組，一般由父親直接傳給兒子。在個人識別方面，由于Y染色體SNPs非隨機分布于人群中，其種群的地域性特異明顯，所以可以用于案件中生物學所屬群體的推斷。尤其在強奸案、輪奸案中分析男女DNA混合物時，Y染色體遺傳標記擴增分型技術對單倍型檢測結果的獲得不受女性成分影響，具有其他遺傳標記所沒有的明顯優勢。因此，23-plex Y-SNPs遺傳標記復合擴增檢測體系在法醫學上具有潛在的特殊價值。

1 材料與方法

1.1主要實驗儀器 ①PCR擴增儀：480型、9600型、9700型（Applied Biosystem，美國）；②定量PCR儀：ABI PRISM7500（Applied Biosystem，美國）；③電脈儀：Bio-RAD公司（美國）；④DNA全自動遺傳分析儀：Prism 310、Prism 3130-XL（Applied Biosystem，美國）；⑤高速臺式離心機：ZKl5、ZK3（Sigma，美國）；⑥超純水儀：Millipore（法國）。

1.2主要實驗試劑 ①SNaPshot試劑盒（Applied Biosystem，美國）；②ExoSAP-IT（USB公司，美國）；③蝦堿性磷酸酶SAP（Amersham公司，美國）；④dNTPs混合物（Fermentas，MBI公司，立陶宛）；⑤Amp FL STR Profiler YfilerTM試劑盒（Applied Biosystem，美國）；⑥Quantifiler human DNA quantification試劑盒（Applied Biosystem，美國）。

1.3實驗樣本及其DNA的提取和定量 在公安部物證鑒定中心隨機抽取290名廣東地區漢族無親緣關系的男性個體，使用采血卡或中性濾紙收集他們的指尖血，編號1-290，采用DNAIQTM（Promega公司，美國）試劑盒進行DNA提取，并且采用Quantifiler TM試劑盒（Applied Biosystem，美國）在ABI PRISM7500定量PCR儀上進行定量，4℃妥善保存，以備Y-SNPs擴增體系的建立和PCR反應條件的優化。

1.4 Y-SNPs遺傳標記復合擴增體系的建立

1.4.1 Y-SNPs位點的選擇 根據Y染色體命名協會的在線補充材料，參考Y-SNPs信息的在線網站和dbSNP數據庫信息，在亞洲人群中篩選出多態性較高的單體群以及對應的23個Y-SNPs位點：P164、P203、P148、P145、M89、P151、M216、P128、P157、P149、P131、P199、P123、P191、P201、M1ll、M9、P132、P200、P197、M119、P136和M134。其中，Ml1l是2 bp缺失，M134是l bp缺失突變，M199是1 bp插入，剩下20個位點均為堿基的轉換或顛換。

1.4.2 Y-SNPs位點PCR引物設計與驗證 以NCBI dbSNP數據庫和Genbank中的Y染色體序列篩選的位點及其鄰近序列為模板，參照引物設計的一般原則，使用Primer Premier 5.0軟件自行設計并使用Oligo 6.0軟件進行分析優化。引物合成后，采用基于局部比對搜索工具（BLAST）快速地對比分析它的高特異性。

1.4.3單個Y-SNPs位點PCR擴增體系的建立 單位點PCR擴增體系的建立。1個男性DNA樣本定量后，分別對23個Y-SNPs位點引物進行單獨擴增，建立每個SNP位點均適用的PCR擴增體系。PCR反應體系為25μL，PCR反應條件為：95℃11min，95℃30s、55℃30s、72℃30s，循環35次，最后延伸為72℃10min。

1.4.4 23個Y-SNPs位點復合PCR擴增體系的建立 通過正交實驗的方法，調整PCR反應參數、PCR反應體系中各離子的濃度以及各引物對的濃度，建立23-plex Y-SNPs復合PCR擴增體系。PCR反應體系為25μL，包括：0.4～1ng DNA模板、2.5 U AmpliTaqGold DNA聚合酶、1×PCR buffer、PCR引物濃度在0.006 8～0.0676μmol/L、每種dNTP各600μmol/L、8 mmol/L MgCl2。PCR反應條件為：95℃11min，95℃30s、55℃40s、65℃45 s，循環35次，最后延伸為65℃10min[1]。

1.4.5 PCR反應產物的檢測與純化 首先取15μL 10×上樣緩沖液與2μL PCR產物混勻后上樣至6%非變性聚丙烯酰胺凝膠（C=6%，T=3.3%），450 V電泳2～3h，銀染顯色。然后，使用8μL或7μL酶純化體系進行PCR產物純化。

1.4.6單堿基延伸反應體系的建立及其產物的純化 采用SNaPshot試劑盒（Applied Biosystem，美國）推薦的反應體系：純化后的PCR產物、微測序引物混合物以及去離子水分別2μL，SNaPshot mix 4μL。循環參數為：96℃10 s，50℃5 s，60℃30 s，循環25次。單堿基延伸反應結束后，向反應產物加入1μL SAP（1 U/μL），37℃孵育1h，80℃15 min進行純化處理，并去除多余的引物和ddNTPs。

1.4.7熒光標記和毛細管電泳檢測 ①4種不同熒光物質標記ddNTPs，故ddNTP所發射的熒光量亦有差異，藍色（FAM）、綠色（HEX）、黃色（TAMRA）、紅色（ROX）熒光物質發射的熒光比約為4：2：1：1，判讀結果時必須對不同熒光標記的RFU值進行標準化[2]；②采用3130-XL遺傳分析儀對純化后的單堿基延伸反應產物進行電泳檢測。取1μL純化產物加入10μL Hi-Di甲酰胺中，再加入0.3μL GeneScanTM Size Standards LIZ-120作為內標。進樣時間10s，電壓15kV，POP-4凝膠，36cm毛細管，電泳30min。毛細管電泳結束后，使用Genemapper ID V3.2軟件對結果進行分析。

2 結果

2.1檢測結果 23-plex Y-SNPs電泳檢測顯示：23個位點均為單倍型，各個位點PCR擴增均衡，多次重復試驗結果一致。基因多樣性與單倍型多樣性的計算公式為：h=n（1-∑X2i）/（n-1）。經法醫學參數計算，23個Y-SNPs位點均具有遺傳多態性，每個位點基因的多樣性范圍為0.0137～0.4912。檢測的290名男性個體中有11種單體群、143種單倍型，其單倍型多樣性為0.9907。

2.2法醫學應用 ①靈敏度：倍比稀釋濃度為200ng/μL的參照DNA，分別進行復合PCR反應和復合單堿基延伸反應，25μL復合體系中DNA含量為0.1～50ng時均可得到較好的分型結果；②種屬特異性：利用磁珠法提取雄性猴、狗、豬、雞、黃牛、山羊、家兔、大白鼠等動物的DNA.建立復合PCR擴增體系，結果顯示動物標本中均未檢測到任何Y-SNPs位點；③組織同一性：任何男性個體自身的骨骼、肋軟骨、肌肉組織、皮膚、肝臟、血痕、指甲等進行23-plex Y-SNPs復合檢測，分型一致。

3 討論

本研究建立的23-plex Y-SNPs復合檢測體系具有良好的男性特異性和種屬特異性，檢測靈敏度高、重復性好。23-plex Y-SNPs復合檢測體系在法醫學上的應用是可行的，尤其是對父系家族的親權鑒定、無名男尸的個人識別、混合斑男性成分的檢驗等具有積極意義[3～6]。常規DNA指紋、ABO血型、酶型、RFLP、STR等傳統的法醫學物證檢驗在法醫學實踐中均存在一定的局限性。在刑事案件中，尤其是涉及追溯父子關系和性犯罪的案件，譬如：內褲上精斑等犯罪案件的檢驗樣本，采用直接檢測Y-SNPs的方法可有效避免傳統檢測的繁瑣步驟，從而快速獲得準確的檢測效果。在23-plex Y-SNPs系統的基礎上，聯合使用STR系統和常染色體SNP檢測系統，其結果清晰、靈敏度高、重復性好、穩定性強，在法醫學領域有廣闊的應用前景。

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編輯/成森