同步輻射X射線小角散射溶液樣品蠕動實驗裝置的研制

李怡雯，邊風剛，洪春霞，趙 鎳，楊春明，王 劼

(1.中國科學院 上海應用物理研究所，上海 201204；2.中國科學院大學，北京 100049)

同步輻射X射線小角散射溶液樣品蠕動實驗裝置的研制

李怡雯1,2，邊風剛1,*，洪春霞1，趙 鎳1,2，楊春明1，王 劼1,*

(1.中國科學院 上海應用物理研究所，上海 201204；2.中國科學院大學，北京 100049)

研制了用于同步輻射X射線小角散射實驗的溶液樣品蠕動實驗裝置，其主要特點為可有效抑制X射線對溶液樣品的輻射損傷、密封性能好、操作簡便，且背景散射低、消耗樣品量小，還可根據實驗要求實現對樣品溫度的控制，進行變溫原位測量。此外，通過實驗對該裝置的進樣量和蠕動速度進行了標定，對防輻射損傷效果進行了驗證。結果表明，該裝置控制精度高，并可有效減小X射線在測量過程中對樣品的輻射損傷。

同步輻射；X射線小角散射；輻射損傷；蠕動實驗裝置

小角X射線散射(SAXS)是由于物質內部存在的電子密度起伏從而在偏離入射X射線光束很小的角度范圍內引起的散射現象[1]。20世紀50年代前后，開始將SAXS用于獲取蛋白質的結構信息[2-3]。在隨后的幾十年里，隨著高通量的同步輻射光束線的建設、相關探測技術的發展及各種計算方法的完善，同步輻射小角散射技術逐漸成為研究蛋白質等生物大分子亞微觀結構和形態的一種重要工具。

目前，解析蛋白質結構主要依靠X射線衍射(XRD)、核磁共振(NMR)和冷凍電子顯微鏡等實驗技術。與這些實驗技術相比，SAXS幾乎不受粒子大小、樣品晶體等條件的限制，可對溶液狀態(更接近生理狀態)下分子質量從kDa到幾MDa范圍內的樣品進行研究，得到其大小、形態等低分辨率三維結構信息。特別地，由于第3代同步輻射光源的強度高、穩定性好等特點，結合先進的探測成像系統，SAXS還可用于蛋白質折疊、去折疊等構象變化的動態研究[4-5]。

SAXS要求用于結構分析的樣品具有單分散性，即要求體系中所有的大分子粒子的尺寸和形狀必須完全一致。在實驗前，可通過動態光散射或分析超速離心驗證樣品的單分散性。但由于實驗中高通量同步輻射光的照射，X射線對蛋白質等生物樣品的輻射損傷往往會破壞體系的單分散性。高通量的X射線照射溶液樣品時會激發水分子產生羥基或超氧化氫自由基，溶劑中的自由基迅速結合到氨基酸支架以及側鏈上(結合常數為109～1010L/mol/s)，與自由基相結合的蛋白彼此間通過共價鍵及非共價鍵聚集在一起[6]，導致其二級和三級結構扭曲[7]。在SAXS測量中，蛋白質若受到輻射損傷，最常見的情形是發生集聚。由于小角度內的散射曲線反映的是樣品內納米尺度粒子的大小和形狀，所以蛋白的集聚會嚴重干擾SAXS的測量，即使廣角X射線散射(WAXS)也會受到蛋白質輻射損傷的影響[8]。因而，如何減小測量過程中X射線對蛋白質等溶液樣品的輻射損傷，獲得有效的實驗數據，是所有同步輻射線站所面臨的共同問題。

減小SAXS生物大分子溶液樣品輻射損傷最普遍的方法是在樣品中添加乙醇、EDTA、DTT等還原劑來清除輻解自由基[9]，或添加甘油、乙二醇、蔗糖等低溫防護劑[10]。但這同時也會給測量帶來許多麻煩，如改變了蛋白質的穩定性、增加了溶劑的黏度、減小了溶劑與溶質的散射對比度等。另外，與XRD晶體低溫測量法類似，在SAXS中也可通過快速冷卻將溶劑玻璃化，低溫冷凍的蛋白質、核酸等生物大分子所能承受的輻射劑量是常溫下的2倍[11]。但與XRD晶體低溫測量不同，溶液快速冷卻后溶劑散射信號的增強以及冰微晶的產生等因素均增加了背底扣除的難度。

除添加還原劑、快速冷卻等方法，通過改變樣品本身來降低輻射損傷外，測量方法與樣品池的設計也同樣影響蛋白質所受輻射損傷的程度。例如，Hong等[12]設計了一種靜態樣品池，并采用二維掃描式曝光來降低單位體積內輻解自由基的累積，獲得有效的SAXS數據。Lipfert等[13]設計了一種樣品池裝置，可方便實現溶液樣品靜態與動態測量模式的切換，在動態模式下，樣品依次流過通光口。與靜態測量模式相比，流動狀態下單位體積樣品的曝光時間縮短，所受輻射損傷顯著降低。但該裝置的樣品消耗量大(0.7～1 mL)，且不便于進行溫度控制的原位測量。

本文擬研制一種溶液樣品蠕動實驗裝置，以降低同步輻射測量過程中X射線對樣品的輻射損傷，減少樣品消耗量，并實現對樣品溫度的控制，進行變溫原位測量。

1 裝置結構

圖1 裝置總體結構Fig.1 Overall structure of device

溶液樣品蠕動實驗裝置如圖1、2所示。

該溶液樣品蠕動實驗裝置主要包括：底座、控溫室、樣品室、容器、注射器、側座及低溫恒溫槽。其中，控溫室頂部設有循環液出入口，通過與低溫恒溫槽相連將恒溫循環液通入控溫室中；樣品室設于控溫室的內部，由依次密封連接的上導管、毛細管和下導管組成；容器與下導管的下端口相連，用于盛放待測溶液樣品；注射器與上導管的上端口連接；側座從控溫室的側壁突出延伸，側座上設有螺絲孔，以便于將該裝置通過側座固定在同步輻射線站的樣品臺上，同理，底座上也設置了螺絲孔，用于固定該裝置。

圖2 裝置主體結構主視圖(a)和左視圖(b)Fig.2 Front view (a) and left view (b) of main part of device

控溫室的左、右側壁上對應于毛細管的高度還分別對稱開有通光口，溶液樣品在注射器的作用下從容器吸入到毛細管中，達到與通光口對應的高度處時在注射器的作用下來回蠕動。該裝置可設定樣品蠕動速度(一般設為10～40 μL/s)，由于測試過程中樣品持續蠕動，

高通量同步輻射光會照射到樣品不同位置，使單位體積樣品的曝光時間縮短，因此樣品所受輻射損傷降低。該裝置采用的石英玻璃毛細管的壁厚為0.01 mm，該毛細管對光束吸收少，背景散射低，有利于弱散射信號溶液樣品的測量。此外，控溫室樣品材料采用導熱率較好的銅，通過恒溫循環液精確控制樣品室的溫度(-5～95 ℃)。

該裝置使用的低溫恒溫槽型號為DCY-0506(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，注射器型號為Microlab 600(Hamilton)。該裝置進樣與蠕動的控制系統軟件采用Labview編寫，運行在windows系統下，其控制界面如圖3所示。當同步輻射實驗站光閘開啟后，由于實驗人員不能近距離操控樣品，因此需用該控制軟件遠程調節注射器上的步進電機驅動絲杠，實現溶液的進樣與蠕動。

2 裝置標定

計算機遠程控制注射器將樣品吸入到通光口處的毛細管內，并使其來回蠕動。由于蛋白質等生物樣品制備產額低且較為昂貴，該注射器采取μL量級進樣，所以有必要對該裝置的進樣精度進行標定。此外，蠕動速度的大小決定著該裝置能否有效防止X射線對樣品的輻射損傷，考慮到液體的黏度特性會使注射器設定的蠕動速度與樣品溶液實際蠕動速度存在偏差，因而需對裝置的蠕動速度進行標定。

圖3 蠕動實驗裝置控制界面Fig.3 Control interface of peristaltic device

2.1 進樣量的標定

表1 進樣量的標定Table 1 Calibration of sample volume

2.2 蠕動速度的標定

將甘油與去離子水(去離子水的黏度為1 mPa·s)按不同比例混合，配制1組具有黏度梯度的樣品溶液，采用如圖4所示的光電檢測方法測量溶液在毛細管中的蠕動速度，平行測量多次，取平均值。

如圖4所示，在石英玻璃毛細管一側放置He-Ne激光器(25-LHP-213-230，美國CVI Melles Griot公司)，由分束器和反射鏡將原光束分成兩條平行光束，對面放置光電探測器(PDA 100A，Thorlabs公司)。被測溶液流過毛細管時，光電探測器接收到的光信號強度與沒有溶液流過時的明顯不同，因此，通過監測示波器(TDS 2024B，Tektronix公司)上兩個光電探測器輸出端電壓信號變化的時間差，即可估算出溶液流經毛細玻璃管a點至b點的平均蠕動速度。

圖4 裝置蠕動速度的光電檢測方法示意圖Fig.4 Schematic of photoelectric detection method for peristaltic rate of device

將注射器的蠕動速度分別設定為10、40、80 μL/s，利用圖4所示的光電檢測方法，測量裝置的蠕動速度隨溶液黏度的變化，結果如圖5所示。流體黏性不僅表現在相鄰兩層流體作相對運動時有內摩擦作用，而且還表現在流體對固體表面具有粘附作用，即分子之間的內聚力將流體粘附在固體表面，隨固體一起運動或靜止[14]。因而，在毛細管內，作定常流動的流體其速度剖面是上下對稱的拋物線形，如圖6所示。當注射泵設置的蠕動速度相同，即體積流量一致時，黏度越大的流體形成的壁面分界層越厚，相應地管軸中心主流區的流動通道變窄，為通過相同的體積流量，在窄截面上的流動速度加快，而本文選用的光電檢測方法測得的正是毛細管管軸中心的流速。

圖5 裝置的蠕動速度隨溶液黏度的變化Fig.5 Change of peristaltic rate of device with solution viscosity

圖6 毛細管截面上定常流動流體的軸向速度分布[14]Fig.6 Axial velocity distribution of steady flow in cross section of capillary[14]

如圖5所示，溶液黏度越接近1 mPa·s，實測蠕動速度越接近注射器設定的蠕動速度，表明毛細管壁附近與管軸中心的速度差越小。通常情況下，SAXS實驗選取的蛋白質濃度范圍為0.1～20.0 mg/mL，其相對黏度約為1.00～1.10，與去離子水的黏度1 mPa·s較為接近。因而，該濃度范圍內樣品的實際蠕動速度與設定的蠕動速度基本一致，相對誤差小于1.3%。實驗所選取的石英玻璃毛細管的內徑為(1.98±0.02) mm，由毛細管內徑誤差所導致的計算后的實測蠕動速度的誤差也示于圖5。

3 防輻射損傷效果

SAXS實驗在上海同步輻射光源(SSRF)小角散射實驗站(BL16B)進行。探測器采用的是Mar165CCD，實驗選取的入射光波長為0.124 nm，通量約為6.0×1010s-1，樣品到探測器的距離為1 993 mm。

實驗前，先將溶菌酶蛋白溶于含100 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-Base、pH=7.6的緩沖溶液中，配成2.5、5、7、9 mg/mL系列濃度的溶液，然后用離心機在4 ℃下以14 000 r/min離心10 min以去除雜質。將溶液樣品蠕動裝置安裝在同步輻射實驗臺上，調節光路使入射光經過通光口照射到毛細管內的溶液樣品上(進樣量為60 μL)，散射信號經過真空管道由CCD收集(圖7)。分別測量樣品曝光前、后溶劑的散射信號，并保持樣品與溶劑的曝光時間相同。測量完成后，利用Fit-2D軟件[15]將探測器收集的二維散射強度譜轉化為散射強度I與散射矢量q的一維曲線，并扣除本底散射，獲得目標蛋白的散射信號。對不同濃度樣品的散射信號進行歸一化處理后發現，其散射曲線的形狀保持一致，排除了所選濃度范圍內樣品形狀隨濃度變化的可能。

圖7 安裝于上海同步輻射光源16B線站上的溶液樣品蠕動實驗裝置(a)和CCD收集到的二維散射圖(b)Fig.7 Peristaltic device installed on SSRF 16B beamline (a) and 2D scattering profile collected by CCD (b)

為更好地驗證該裝置的防輻射損傷效果，本實驗采取2種曝光模式：1) 樣品靜止曝光；2) 樣品蠕動曝光。通過對比2種曝光模式下樣品的散射曲線及回旋半徑的變化，進而分析樣品受到的輻射損傷程度。圖8為濃度為2.5 mg/mL的溶菌酶溶液在靜止和蠕動(10 μL/s)2種模式下連續3次曝光100 s所測得的散射曲線。圖9為2種模式下溶菌酶散射曲線的Guinier圖。由圖8a和9a可見，樣品在靜止模式下，隨曝光次數的增加，在低q區的散射曲線出現了上揚，相應地Guinier圖斜率變大，溶菌酶蛋白逐漸集聚變性[10]；由圖8b和9b可見，樣品在蠕動模式下，散射曲線幾乎不隨曝光次數的增加而變化，低q區的散射曲線重合，相應地Guinier圖斜率也幾乎不變，樣品蛋白未發生明顯集聚。靜止模式3次曝光測得的溶菌酶回旋半徑依次為1.43、1.65、1.76 nm，可見溶菌酶回旋半徑隨著曝光次數的增加而增大。蠕動模式3次曝光測得的回旋半徑依次為1.53、1.59、1.57 nm，可見，在蠕動模式下，溶菌酶回旋半徑基本不隨曝光次數變化。

圖8 2.5 mg/mL溶菌酶溶液在靜止(a)與蠕動(b) 2種模式下的散射曲線Fig.8 Solution scattering profiles obtained from 2.5 mg/mL lysozyme using stationary collection mode (a) and peristaltic collection mode (b)

圖9 2.5 mg/mL溶菌酶溶液在靜止(a)與蠕動(b) 2種模式下測得的散射曲線的Guinier圖Fig.9 Guinier plots of scattering profiles from 2.5 mg/mL lysozyme using stationary collection mode (a) and peristaltic collection mode (b)

此外，將5 mg/mL的溶菌酶在2種模式下分別曝光300 s，其散射曲線和Guinier圖分別示于圖10、11，測得的回旋半徑分別為1.67 nm和1.52 nm。將蠕動模式下測得的溶菌酶散射曲線、回旋半徑與Bioisis數據庫中標準散射曲線(Bioisis ID：LYSOZP)及回旋半徑參考值(1.52±0.10) nm相比(圖12)，可知該蠕動測量裝置不僅可準確獲得樣品的散射信息，而且還抑制了蛋白質的集聚，達到了很好的防輻射損傷效果。

圖10 5 mg/mL溶菌酶溶液的散射曲線及溶菌酶標準曲線Fig.10 Scattering profiles obtained from 5 mg/mL lysozyme and standard curve of lysozyme

圖11 5 mg/mL溶菌酶溶液散射曲線的Guinier圖Fig.11 Guinier plots of scattering profiles obtained from 5 mg/mL lysozyme

圖12 回旋半徑隨曝光時間的變化Fig.12 Gyration radius vs exposure time

4 結論

介紹了一種用于同步輻射X射線小角散射的溶液樣品蠕動實驗裝置。以溶菌酶散射實驗為例，在蠕動和靜止2種測量模式下分別測得了溶菌酶的散射曲線和回旋半徑。結果表明，利用該裝置不僅可準確地獲得樣品的散射信息，還可有效減小高通量同步輻射光在測量過程中對樣品的輻射損傷，特別是對輻射敏感的蛋白質類樣品的損傷。

該裝置密封性能好，未發生漏液等情況，且操作簡便、背景散射低、樣品消耗量小、控制精度高，滿足微量測量的實驗需求。此外，該裝置也可實現對樣品溫度的控制，進行變溫原位測量。經實驗驗證，該裝置滿足同步輻射X射線小角散射實驗要求，可用于蛋白質等輻射敏感溶液樣品的相關研究。

[1] GUINIER A, FOURNET G, WALKER C B, et al. Small-angle scattering of X-ray[M]. New York: John Wiley & Sons Inc., 1955.

[2] KRATKY O. Low-angle scattering in polymers[J]. J Polymer Science, 1948, 3: 195-215.

[3] RITLAND H N, KAESBERG P, BEEMAN W W. An X-ray investigation of the shapes and hydrations of several protein molecules in solution[J]. J Chem Phys, 1950, 18: 1 237-1 242.

[4] KATHURIA S V, GUO L, GRACEFFA R, et al. Minireview: Structural insight into early folding events using continuous-flow time-resolved small-angle X-ray scattering[J]. Biopolymers, 2011, 95: 550-558.

[5] ARAI M, ITO K, INOBE T, et al. Fast compaction of alpha-lactalbumin during folding studied by stopped-flow X-ray scattering[J]. J Mol Biol, 2002, 321: 121-132.

[6] GARRISON W M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins[J]. Chem Rev, 1987, 87: 381-398.

[7] DAVIES K J A, DELSIGNORE M E. Protein damage and degradation by oxygen radicals, Ⅲ: Modification of secondary structure and tertiary structure[J]. Biol Chem, 1987, 262: 9 908-9 913.

[8] FISCHETTI R F, RODI D J, MIRZA A, et al. High-resolution wide-angle X-ray scattering of protein solutions: Effect of beam dose on protein integrity[J]. J Synchrotron Rad, 2003, 10: 398-404.

[9] MALEKNIA S D, RALSTON C Y, BRENOWITZ M D, et al. Determination of macromolecular folding and structure by synchrotron X-ray radiolysis techniques[J]. Anal Biochem, 2001, 289: 103-115.

[10]KUWAMOTO S, AKIYAMA S, FUJISAWA T. Radiation damage to a protein solution, detected by synchrotron X-ray small-angle scattering: Dose-related considerations and suppression by cryoprotectants[J]. J Synchrotron Rad, 2004, 11: 462-468.

[11]MEISBURGER S P, WARKENTIN M, CHEN H M, et al. Breaking the radiation damage limit with cryo-SAXS[J]. Biophysical J, 2013, 104: 227-236.

[12]HONG Xinguo, HAO Quan. Measurements of accurate X-ray scattering data of protein solutions using small stationary sample cells[J]. Rev Sci Instrum, 2009, 80: 014303.

[13]LIPFERT J, MILLETT I S, SEIFERT S, et al. Sample holder for small-angle X-ray scattering static and flow cell measurements[J]. Rev Sci Instrum, 2006, 77: 046108.

[14]丁祖榮. 流體力學[M]. 北京:高等教育出版社,2003.

[15]HAMMERSLEY A P, SVENSSON S O, HANFLAND M, et al. Two-dimensional detector software: From real detector to idealized image or two-theta scan[J]. High Press Res, 1996, 14: 235-248.

Development of Peristaltic Device for Solution Sample Measurement by Synchrotron Radiation Small-angle X-ray Scattering

LI Yi-wen1,2, BIAN Feng-gang1,*, HONG Chun-xia1, ZHAO Nie1,2,YANG Chun-ming1, WANG Jie1,*

(1.ShanghaiInstituteofAppliedPhysics,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201204,China;2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

A peristaltic device for solution sample measurement applied in small-angle X-ray scattering at synchrotron radiation was developed. The radiation damage can be efficiently restrained by using this device whose features are good sealing, easy operation, low background scattering, small sample consumption, and the sample temperature can be controlled for in-situ measurement. The sample volume and peristaltic rate of the device were calibrated, and the validity of reducing radiation damage was also verified. The results indicate that this peristaltic device is an effective tool for precise X-ray scattering measurements with high control accuracy.

synchrotron radiation; small-angle X-ray scattering; radiation damage; peristaltic device

2014-03-27;

2014-05-20

973計劃資助項目(2011CB911104)

李怡雯(1988—)，女(蒙古族)，黑龍江齊齊哈爾人，博士研究生，核技術及應用專業

*通信作者：邊風剛，E-mail: bianfenggang@sinap.ac.cn；王 劼，E-mail: wangjie@sinap.ac.cn

O722.5

A

1000-6931(2015)10-1914-07

10.7538/yzk.2015.49.10.1914