3種結核桿菌檢測方法在結核病診斷中的應用研究

王志佳，石少敏，李 丹

3種結核桿菌檢測方法在結核病診斷中的應用研究

王志佳1a，石少敏1b＊，李 丹2

（1.吉林大學中日聯誼醫院a放射線科；b呼吸內科，吉林長春130033；2.吉林省人民醫院感染科）

結核病（TB）是一類由結核分枝桿菌引起的慢性肉芽腫性的炎癥，結核分枝桿菌可感染全身多個系統，其中最常見的是肺結核。據統計，當前全球已有1／3的人口為結核病患者［1］，每年約800萬－1000萬名患者最終發展成活動性結核病患者，每年約200－300萬人死于肺結核［2］。近年來，由于耐多藥結核病（MDR－TB）的流行與傳播、HIV患者的感染，以及全球人口流動等問題的出現，使結核病疫情日趨嚴峻，已成為嚴重的社會及公共衛生問題，TB的預防和控制顯得尤為重要。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2013年7月至2014年3月收集175例本院（吉林大學中日聯誼醫院）呼吸內科就診的疑似活動性結核病人，收集病例完成后對所有病例進行初步的評估，依據評估可以分為二組：活動性結核病患者組、非活動性結核病患者組（臨床的表現可以排除結核）。活動性結核病病人組又進一步分為確診組和臨床診斷組，如果實驗室結核桿菌培養為陽性的或者有明確的病理學診斷依據的歸入確診組；臨床表現疑似結核病患者，通過抗結核治療有一定的效果的患者歸位臨床診斷組。

1.2 研究方法

標本為研究對象的痰液、胸腔積液或支氣管鏡肺泡灌洗液。

（1）結核桿菌檢測試劑盒（膠體金法）試驗 通過定性檢測結核菌的分泌性蛋白質，當有兩條線同時出現時可判斷為陽性，只有一條對照線出現時則判斷為陰性，其反應時間15分鐘，即可判讀結果。

（2）TST實驗 使用孟都氏法在檢測者左前臂的內側皮下注射PPD（0.lml同時含BCG－PPD 5IU），測試者局部形成了明顯的皮丘。注射后48－72小時后測量在皮膚上形成的硬結的直徑大小，橫徑和縱徑平均值為硬結平均直徑（d）d＜5mm定義為陰性病例（－）；d介于5mm到9mm之間定義為弱陽性病例（＋）；d介于10mm到19mm之間定義為陽性病例（＋＋）；d＞20mm出現破漬、水泡、雙圈強陽性定義為強陽性病例（＋＋＋）

（3）結核桿菌DNA PCR檢測 取測試者痰液標本，5%氫氧化鈉處理兩小時后置于EP管中離心10分鐘（13000轉）后去除離心后的上清，于沉淀物中加入生理鹽水，繼續離心10分鐘（同轉速）。去除離心后的上清，于沉淀中加入TB溶液（30μl），混勻后水浴，首先100℃水浴30分鐘，然后37℃水浴10分鐘，繼續離心10分鐘（同轉速），取離心后上清加入反應液中，進行PCR檢測。

1.3 統計學處理

統計學處理釆用SPSS13.0統計軟件對結果進行統計分析，其中計數資料采用χ2檢驗方法進行分析，P≤0.05定義為有統計學差異。

2 結果

最終診斷為結核病46例（26.2%），男女比例3∶1，中位年齡40.2歲。確診組46例中，病理確診1例；結核桿菌培養陽性41例，余4例診斷為臨床診斷結核病，為試驗性抗結核治療有效，且均為結核性胸膜炎；非活動性結核病的患者共110例，男女比例為3∶1，中位年齡46歲，其中肺部感染55例、間質性肺病11例、膿胸2例、消化系統感染3例、血液系統疾病3例、惡性腫瘤15例、風濕免疫系統疾病11例、心功能不全6例、AIDS 4例。

2.1 比較膠體金法、PCR、TST三種不同的方法診斷活動性結核患者敏感度

在最終診斷為結核病的46例患者中，34例膠體金法檢測陽性，12例陰性，本研究將膠體金法檢測結果為（＋）、（＋／－）均統一定性為陽性，該方法對于診斷活動性結核病的敏感度為73.9%。本研究將結核菌素實驗TST應用檢測患者的皮膚硬結直徑大小，如果直徑大于10mm均定義為陽性，其中31例患者利用TST法檢測呈現陽性，15例被檢測為陰性，TST法檢測對于診斷活動性結核病的敏感度為67.4%。PCR檢測的46例患者中，21例被定義為陽性，25例被定義為陰性，此方法的診斷敏感度為45.7%。膠體金法與TST敏感度比較無明顯差異（P＞0.05），膠體金法與PCR敏感度比較有明顯差異（P＜0.01）（見表1）。

46例活動性結核病患者，其中16例患者膠體金法測陽性，14例TST檢測陽性，9例PCR檢測陽性，三種檢測結核性胸膜炎的敏感度分別為72.7%、63.6%、40.9%。膠體金法與TST敏感度比較無明顯差異（P＞0.05）。膠體金法與PCR敏感度比較有明顯差異（P＜0.05）。

2.2 比較膠體金法、TST、PCR在診斷活動性結核病中的特異度

通過臨床特征和檢測排除活動性肺結核的110例患者中，利用膠體金法檢測結果顯示有89例結果為陰性，檢測的特異度高達80.9%，52例患者TST檢測為陰性，其特異度為47.3%，95例患者行PCR檢測陰性，其特異度為86.4%，膠體金法與TST特異度比較有顯著差異（P＜0.001），前者明顯大于后者；膠體金法與PCR特異度比較無差異（P＞0.05），二者特異度均較高（見表1）。

110例非活動性結核病患者28例行抗原膠體金法檢測23例陰性，行TST檢測13例陰性，行PCR檢測24例陰性，三種檢測結核性胸膜炎的特異度分別為82.1%、46.4%、85.7%。膠體金法與TST特異度比較有明顯差異（P＜0.05），膠體金法與PCR特異度比較無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 比較膠體金法、TST、PCR檢測疾病的符合率

膠體金法、TST方法以及PCR方法對結核病患者和非結核病患者進行檢測，檢測的符合率分別為78.8%、53.2%、74.4%。膠體金法、TST、PCR鑒別結核性胸膜炎與非結核性胸膜炎的符合率分別為78.0%、54.0%、66.0%。膠體金法與TST比較有統計學意義，（P＜0.01），膠體金法與PCR比較無統計學差異（P＞0.05）（見表1）。

表1 三種檢測方法敏感度、特異度、符合率的比較

3 討論

目前在我國，僅活動性肺結核病人約450萬，且正逐漸增多。近年來由于各種原因，使得耐藥結核病人，尤其是MDR－TB病人不斷增加，而臨床上用于MDR－TB的有效抗癆藥物療效有限，使國民生活質量受到嚴重影響，結核病亦受到全球的重視。

1999年，研究者利用基因芯片技術對H37Rv（結核桿菌標準株）和BCG基因組進行了檢測比較，發現了在BCG中缺失的而僅存在于結核桿菌中的129個開放讀碼框，這些開放讀碼框可以劃分為16個區域（RD1－RD16），統稱為RD區片段［3］。RD區編碼的蛋白包括ESAT－6、CFP－10、MPT64、38 kDa、30kDa、Rv3871、Rv3872、Rv3873等，其中ESAT－6、CFP－10是MTB生長早期分泌的特異性蛋白［4］，MTP64是一種特異性的蛋白質［5］，其屬于MTB的一種代謝產物，檢測MTP64蛋白質的水平可以反映MTB總體的生長情況，近年來應用重組技術及雜交技術可制備一些單克隆抗體，像ESAT－6、CFP－10、MPT64，這些單克隆抗體可以被應用于MTB的病原的科研中同時對結核病的診斷也有一定的意義［6］。結核菌檢測試劑盒（膠體金法）是一種采用上述單克隆抗體作為膠體金標記抗體來檢測結核菌分泌的特異性抗原的檢測工具，此方法可快速簡便地檢測各種液體標本中的特異性抗原。提高檢測的特異性和靈敏度可以通過采用多種抗原聯合檢測的手段。

實驗結果顯示，膠體金法與TST檢出結核菌的能力相似而高于PCR法。在結核性胸膜炎中亦存在同樣的結果。本研究中46例活動性結核病患者出現了12例陰性，其中3例口服莫西沙星片，5例靜脈注射莫西沙星，Johnson JL［7］的實驗認為莫西沙星（MXFX）可于感染初期有效殺菌作用，殺菌作用略低于抗結核藥物異煙肼（INH），MXFX能很好的滲入結核病變中，能快速殺滅空洞性肺結核病人痰中部分結核桿菌，這可能是該12例患者檢測陰性的原因。另有4例患者留取的血性或膿性痰標本培養陽性而膠體金法檢測為陰性，可能是因為該標本所含的其他成分對結核菌分泌蛋白的萃取和釋放產生干擾，無法得出可靠結果，或者痰標本存在的不均一性致使取樣差異引起。

本研究中TST特異度與Pai M［8］等的研究中所得結果相符，在非活動性結核病組中，膠體金法與TST特異度比較P＜0.05，有明顯統計學差異；膠體金法與PCR特異度比較P＞0.05，無統計學差異。在非結核性胸膜炎的胸水中膠體金法與TST特異度比較有顯著差異，說明膠體金法在排除非活動性結核病的能力明顯優于TST；膠體金法與PCR特異度比較無明顯差異，提示膠體金法與PCR在排除非活動性結核性疾病的能力相似，且兩種方法在兩組中特異度均較高。

本試驗發現PCR技術雖然具有較高敏感度及特異度，但仍不可避免出現假陽性反應，因此PCR技術還存在穩定性不高的因素，這些可能有多方面的因素引起，例如操作的失誤，標本本身的因素等［9］。

似然比不受患病率的影響，并且檢測的穩定性很高，可以通過其判斷實驗診斷結果顯示出的陽陰性是患者患病的大致概率。本研究發現，在診斷活動性結核病與非活動性結核病中膠體金法的陽性預測值明顯高于其他兩種檢測方法，有統計學意義，陰性預測值無統計學意義，本研究中，膠體金檢測的PLR為3.87，為三種方法中最高的，NLR為0.32為三種方法中最低的，在結核性胸膜炎的檢出中亦得到了同樣的趨勢。

綜上所述，膠體金法具有結果可靠，操作簡單、快速，不需進行鏡下觀察；適用于一般人群普查快速檢測。膠體金法檢測活動性結核病的敏感度較高，且檢測能力較TST強，但是也存在著預測值不是很高的不利因素，因此其對結核病的診斷還需要結合患者的臨床表現。

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石少敏（1981－），主治醫師，講師，主要從事呼吸系統疾病研究。

2014－10－15）

1007－4287（2015）10－1788－03

＊通訊作者