不同缺血后處理方案對家兔擠壓綜合征損傷保護效應的實驗研究

王金墻，劉子泉，丁 輝，樊毫軍，董文龍，宋美娟，侯世科

·論著|ORIGINAL ARTICLES·

不同缺血后處理方案對家兔擠壓綜合征損傷保護效應的實驗研究

王金墻1，劉子泉2，丁 輝2，樊毫軍2，董文龍2，宋美娟2，侯世科2

目的 篩選不同缺血后處理(ischemic postconditioning，IPost)方案對家兔擠壓綜合征(crush syndrome，CS)損傷保護效應的最佳時間窗。方法 選取48只家兔隨機分為對照組(S組)及5個不同IPost方案組(IPA～IPE組)，每組8只。建立CS模型，并于解壓前游離雙下肢股動、靜脈，解壓后IPA組給予阻斷下肢血流5 s，再灌注5 s，共5個循環(即5×5 s/5 s)，IPB組5×30 s/30 s，IPC組5×1 min/1 min，IPD組5×5 min/5 min，IPE組3×10 min/10 min，繼續觀察至解壓后24 h。分別于建模前，解壓即刻及解壓后2、6、12、18、24 h時間點檢測家兔血液中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌紅蛋白(myoglobin，Mb)、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的含量。結果 與S組相比，各IPost組均可降低解壓后CS家兔血清CK、Mb和NGAL的含量。在解壓后6、12、18、24 h，IPC、IPD組各指標與S組相比，差異均具有統計學意義(P<0.005)；IPC組各指標較 IPD組低，但解壓后各時間點兩組之間比較無顯著差異。結論 CS家兔再灌注前給予1～5 min的肢體遠隔IPost對損傷具有保護作用，其中給予5個循環的1 min缺血，1 min再灌后處理具有最佳保護效應。

擠壓綜合征；缺血后處理；肌酸激酶；肌紅蛋白；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白

CS指四肢或軀干肌肉豐富的部位，遭受重物長時間擠壓，在解除壓迫后出現的以肢體腫脹、肌紅蛋白尿、高血鉀為特點的急性腎功能損傷，是地震傷亡中僅次于直接創傷以外的第二致死原因[1, 2]。盡管災后發生率僅為8%左右，但因其所導致的死亡卻占總病死率的40%～60%[3]。近年來，我國地震災害頻發，CS的發病率也呈現逐漸增加的趨勢[4]，對社會的安定和經濟的發展造成了重大影響。關于CS的救治，除快速大量補液、堿化尿液、滲透性利尿和防治高血鉀等措施外，應盡早行血液凈化治療[5]，然而多次救援實踐表明，CS患者最早接受血液凈化治療的時間多為震后8 h[4]。因此從解除壓迫至血液凈化治療的這段時間，能否通過其他有效治療手段來減輕或延遲CS所導致的機體損傷？有研究表明IPost在心臟、腎臟、大腦等缺血損傷具有一定的保護作用。目前鮮有關于應用IPost治療CS患者的報道，本研究擬通過動物實驗篩選不同IPost方案對家兔CS損傷保護作用的最佳時間窗。

1 材料與方法

1.1 材料 48只健康成年日本大耳白兔，6～12月齡，體重(2.3±0.2)kg，購自軍事醫學科學院動物實驗中心[許可證號：SCXK(軍)2012-0002]。于實驗前適應性飼養3 d，單只分籠喂養，保持室溫22～26 ℃，濕度60%～65%，自由攝食和飲水，實驗前12 h禁食，正常供水。

1.2 模型建立 參考文獻[6, 7]的造模方法，并結合前期預實驗情況建立家兔CS模型。1%的戊巴比妥鈉3 ml/kg耳緣靜脈麻醉后，使用自動氣壓止血帶(威海市博華醫療設備有限公司)給予家兔單下肢100 kPa擠壓8 h，解壓前游離雙下肢腹股溝處股動、靜脈。

1.3 實驗分組及方法 48只家兔隨機分為6組，每組8只，分別為對照組( S組)，擠壓建模8 h后，不做任何處理。后處理A組(IPA組)，解壓后立即使用動脈夾夾閉動、靜脈5 s，再灌注5 s，循環5次，標記為5×5 s/5 s。同樣，后處理B組(IPB組)，標記為5×30 s/30 s。后處理C組(IPC組)，標記為5×1 min/1 min。后處理D組(IPD組)，標記為5×5 min/5 min。后處理E組(IPE組)，標記為3×10 min/10 min。所有分組在解壓1 h后縫合雙下肢切口，繼續觀察24 h。

1.4 標本處理和檢測 分別在建模前，解壓即刻及解壓后2、6、12、18、24 h時間點，通過耳中動脈留置針抽取2 ml血液，4℃保存1 h后，離心(3000 r/min，15 min)取其上清液，應用全自動生化分析儀檢測CK的含量，采用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)Mb、NGAL的含量，具體操作按照說明書進行。

2 結 果

2.1 一般情況 各組家兔在擠壓建模的過程中均未出現死亡，解壓后均表現為精神萎靡，呼吸急促，四肢冰冷，受壓肢體均不能正常活動，腫脹明顯，遠端肢體呈淤血表現。解壓2 h后各組均出現尿量減少，顏色加深，甚至出現棕紅色尿，解壓18 h后均為無尿狀況。

2.2 血清CK含量變化 解壓時各組血清CK的含量可升高至擠壓前的近10倍，并繼續升高。不同方案組內解壓后各時間點與建模前及解壓即刻相比分別具有統計學意義(P<0.008)。各時間點不同分組間兩兩比較顯示：在建模前及解壓即刻兩個時間點，各組之間比較均無統計學意義(P>0.005)；在解壓后2、6、12、18、24 h時間點，IPC組與S組相比差異均有統計學意義(P<0.005)；在解壓后6、12、18、24 h時間點，IPB、IPD組與S組相比，差異均有統計學意義(P<0.005)；其余各時間點各組與S組相比均無統計學意義；在解壓后12、18、24 h時間點，IPC組與IPA組相比，差異均有統計學意義(P<0.005)；在解壓后18、24 h時間點，IPD組與IPA組相比，IPC組與IPB組相比，差異均有統計學意義(P<0.005)；在解壓后6、12、18、24 h時間點，IPE組與IPB、IPC、IPD組相比均有統計學意義(P<0.005)；其余各時間點各組間差異均無統計學意義。見表1。

2.3 血清Mb含量變化 不同方案組解壓后各時間點血清Mb含量與建模前及解壓即刻相比均具有統計學意義(P<0.008)。各時間點不同分組間兩兩比較結果示：在建模前及解壓即刻兩個時間點，各組之間相比均無統計學意義(P>0.005)；在解壓后2、6、12、18、24 h時間點，IPB、IPC、IPD組與S組相比差異均有統計學意義(P<0.005)，IPA、IPE組與S組相比均無統計學意義；在解壓后2、6、12、18、24 h時間點，IPC、IPD組與IPA組相比，IPE組與IPC、IPD組相比，差異均有統計學意義(P<0.005)；在解壓后6、12、18、24 h時間點，IPC、IPD組與IPB組相比，差異均有統計學意義(P<0.005)；其余各時間點各組間差異均無統計學意義。見表2。

2.4 血清NGAL含量變化 不同方案組解壓后各時間點血清NGAL含量與建模前及解壓即刻相比均具有統計學意義(P<0.008)。各時間點不同分組間兩兩比較結果顯示：在建模前及解壓即刻兩個時間點，各組之間相比較均無統計學意義；在解壓后12、18 h時間點，IPA、IPB、IPE組與S組相比，差異有統計學意義(P<0.005)；在解壓后2、6、12、18、24 h時間點，IPC、IPD組與S組相比，差異有統計學意義(P<0.005)；在解壓后2、6、12、18 h時間點，IPC、IPD組與IPA組相比，IPC組與IPB組相比，IPE組與IPC、IPD組相比差異均有統計學意義(P<0.005)；其余各時間點各組間差異均無統計學意義。見表3。

表1 各組家兔血清CK含量隨時間變化情況 (n=8；×103 U/L；

注： S組為對照組，IPA組為后處理5×5 s/5 s組，IPB組為5×30 s/30 s組，IPC組為5×1 min/1 min組，IPD組為5×5 min/5 min組，IPE組為3×10 min/10 min組；與S組比較，①P<0.005；與IPA組比較，②P<0.005；與IPB組相比，③P<0.005；與IPC組相比④P<0.005；與IPD組相比，⑤P<0.005

表2 各組家兔血清Mb含量隨時間變化情況 (n=8；ng/ml；

注：S組為對照組，IPA組為后處理5×5 s/5 s組，IPB組為5×30 s/30 s組，IPC組為5×1 min/ 1min組，IPD組為5×5 min/5 min組，IPE組為3×10 min/10 min組；與S組比較，①P<0.005；與IPA組比較，②P<0.005；與IPB組相比，③P<0.005；與IPC組相比，④P<0.005；與IPD組相比，⑤P<0.005

表3 各組家兔血清NGAL含量隨時間變化情況 (n=8；pg/ml；

注：S組為對照組，IPA為后處理5×5 s/5 s組，IPB為5×30 s/30 s組，IPC為5×1 min/1 min組，IPD為5×5 min/5 min組，IPE為3×10 min/10 min組；與S組比較，①P<0.005；與IPA組比較，②P<0.005；與IPB組相比，③P<0.005；與IPC組相比，④P<0.005；與IPD組相比，⑤P<0.005

3 討 論

地震災害中擠壓傷多發生于四肢，因下肢肌肉組織豐富，故本研究以家兔下肢作為擠壓位置。在擠壓壓力的選擇上，根據國內外相關實驗研究及災害現場救援情況分析，通常導致患者擠壓傷的重物重量多為患者體重的5～10倍，根據止血帶的有效寬度3 cm計算，故選擇100 kPa作為恒定擠壓壓力。文獻[8]報道，肌肉組織受擠壓2～4 h即可發生損傷，超過6 h可發生不可逆性損傷，隨著擠壓的時間延長，發生CS的可能性逐漸增高。同時多次救援實踐案例調查發現，專業救援人員多在震后5～8 h到達災害現場，部分研究實驗選擇震后8 h作為擠壓綜合征的造模時間[2]，綜合前期預實驗結果，本研究使用自動氣壓止血帶給予家兔單下肢100 kPa壓力8 h以建立家兔CS模型，解壓后家兔下肢出現瘀斑，腫脹嚴重，尿量逐漸減少，甚至出現肌紅蛋白尿及無尿。解剖發現，下肢擠壓處肌肉顏色加深，組織間液明顯增多。解壓后各血液檢測指標顯著升高，說明家兔已發生橫紋肌溶解并導致急性腎衰竭，證明CS建模成功。

IPost是指在組織、器官缺血恢復血供之前，給予短暫、數次的再灌注-缺血的處理過程，以有效改善組織器官發生缺血再灌注損傷。由 Zhao等[9]在2003年利用犬心肌梗死模型試驗中發現，并首次提出了其概念。盡管IPost在心臟、腎臟、大腦等缺血損傷具有一定的保護作用，但不同的時間方案及循環次數產生的治療效果也有所不同。李嵩山等[10]在孕兔失血性休克的實驗研究中發現，給予雙下肢股動脈缺血30 s/再灌注30 s，循環10次后，可以有效的減輕缺血再灌注對腎功能的損傷。Jiang等[11]在切除右腎建立的急性腎衰模型中發現分別給予6個循環的10 s、30 s、1 min的IPost均對腎移植具有炎性反應的保護作用，并且10 s組的缺血后處理效果最佳。Kerendi等[12]利用小鼠的心梗模型，對腎動脈實施單次5 min的遠隔缺血后處理，可以顯著減輕心肌缺血再灌注所導致的損傷。因此研究設計了5 s～10 min的IPost時間窗，進行不同的IPost方案對家兔CS損傷的保護作用的實驗研究。

由于CK、Mb主要存在于骨骼肌和心肌等細胞中，當骨骼肌損傷時，其表達水平可迅速上升；NGAL是急性腎損傷的生物標志物之一，其表達的增加對CS的早期診斷和病情評估具有重要意義。因此，本研究主要以血液中CK、Mb和NGAL的含量作為最佳IPost時間窗的篩選指標。

本研究發現，建模前及解壓即刻，各處理組各指標兩兩比較示差異均無統計學意義；在解壓后6、12、18、24 h，IPC、IPD組血清CK、Mb和NGAL含量與S組相比差異均具有統計學意義；其中血清CK含量IPC、IPD組在解壓后18、24 h與IPA組，解壓后6、12、18、24 h與IPE組相比差異均顯著；血清Mb含量IPC、IPD組在解壓后2、6、12、18、24 h與IPA、IPE組，解壓后6、12、18、24 h與IPB組相比差異均有統計學意義；血清NGAL含量IPC、IPD組在解壓后2、6、12、18 h與IPA、IPE組相比差異均具有統計學意義。解壓后各時間點IPC組各指標較 IPD組低，但兩組之間比較均無顯著差異。說明通過有創IPost可有效降低CS所致機體損傷，其中給予5個循環1 min缺血、1 min再灌注為效果最佳IPost方案。

綜上所述，本研究利用自動氣壓止血帶，建立了穩定的家兔CS模型，通過設置多組不同時間方案，篩選并得出結論：CS家兔再灌注前給予1～5 min的肢體遠隔IPost對損傷具有保護作用，其中給予5個循環的1 min缺血，1 min再灌后處理具有最佳保護效應。IPost操作簡單可行，應用前景廣泛，具有重要臨床價值。但是，關于IPost應用于CS的案例鮮有報道，且本研究為動物實驗，因物種的差異，得出的結論在人類的臨床治療中是否同樣顯著，還需進一步驗證。

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(2015-03-31收稿 2015-04-22修回)

(責任編輯 付 輝)

Experimental study on the protective effect of different ischemic postconditioning scheme in rabbits with crush syndrome

WANGJinqiang1，LIUZiquan2，DINGHui2，FANHaojun2，DONGWenlong2，SONGMeijuan2，andHOUShike2.

1.SpecialtyofEmergencyMedicine,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003,China; 2.InstituteofDisasterandEmergencyRescueMedicine,AffiliatedHospitalofLogisticsCollege,ChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,ChinaCorrespondingauthor:HOUShike,E-mail:houshike@126.com

Objective To screen the best time-window of the protective effect of different ischemia postconditioning (IPost) scheme on rabbits with crush syndrome (CS) injury. Methods 48 healthy Japanese white rabbits were selected and randomly divided into control group (S group) and 5 groups of different IPost scheme (IPA～IPE group), 8 rabbits each. CS model was established, and femoral arteries and veins were separated in the groin of both lower limbs before releasing of pressure. After decompression, the arteries of IPA group were treated with bulldog climp clamping for 5 s, then releasing 5 s, and repeated for 5 cycles (5×5 s/5 s), IPB group was 5×30 s/30 s, IPC group was 5×1 min/1 min, IPD group was 5×5 min/5 min, IPE group was 3×10 min/10 min, observation lasted 24 h after releasing of pressure. The concentration of serum creatine kinase (CK), myoglobin (Mb) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) were detected before establishment of CS model, immediateness after decompression and 2, 6, 12, 18 and 24 h after decompression. Results Compared with S group, the concentration of serum CK, Mb and NGAL were reduced in all Ipost groups after decompression. All indexes of groups of IPC and IPD in 6, 12, 18, 24 h after decompression was statistical significant in comparison with S group (P<0.005); All indexes of IPC group were lower than IPD group in each time point after decompression, but there was no significant difference. Conclusions Giving 1-5 min remote ischemia postconditioning for 5 cycles before reperfusion to rabbits with crush syndrome may produce effective protection to organism injuries; among these groups, IPC group (5×1 min/1 min) showed the most obvious effect.

crush syndrome; ischemic postconditioning; creatine kinase；myoglobin; neutrophil gelatinase-associated lipocalin

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.05.003

國家自然科學基金課題(71173232)；天津市重點支撐項目(12ZCZDSF00700)

王金墻，碩士研究生在讀，E-mail: cnwangjq@126.com

1. 453003，河南省新鄉醫學院急救醫學專業； 2. 300162 天津，武警后勤學院附屬醫院救援醫學研究所

侯世科，E-mail: houshike@126.com

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