低分子量肝素對大鼠腎纖維化的預防作用*

盧 濤， 朱春玲

(1.海口市人民醫(yī)院 腎內(nèi)科， 海南 海口 570000； 2.貴州醫(yī)科大學附院 腎內(nèi)科， 貴州 貴陽 550004)

低分子量肝素對大鼠腎纖維化的預防作用*

盧 濤1， 朱春玲2*

(1.海口市人民醫(yī)院 腎內(nèi)科， 海南 海口 570000； 2.貴州醫(yī)科大學附院 腎內(nèi)科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 觀察低分子量肝素(LMWH)對大鼠腎纖維化的預防作用及機制。方法: 健康SD大鼠54只隨機分為假手術(shù)組、模型組、LMWH組，后兩組采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(UUO)制作腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，LMWH組術(shù)后予LMWH皮下注射，每組分別于手術(shù)后第5天、第10天、第15 天處死6只大鼠，取腎組織HE染色切片通過光鏡觀察各組大鼠腎組織形態(tài), Masson 染色后進行計算腎間質(zhì)損傷指數(shù)，免疫組織化學方法檢測TGF-β1、MMP-2表達。結(jié)果: 同期模型組腎間質(zhì)損傷指數(shù)、TGF-β1 表達高于假手術(shù)組(P<0.05)，MMP-2 表達低于假手術(shù)組(P<0.05)；術(shù)后10 d和15 d LMWH組腎間質(zhì)損傷指數(shù)及TGF-β1 表達低于模型組(P<0.05)，MMP-2 表達高于模型組(P<0.05)。結(jié)論: LMWH可能是通過抑制TGF-β1表達、促進MMP-2表達，從而減輕UUO大鼠腎小管間質(zhì)纖維化。

肝素，低分子量； 轉(zhuǎn)化生長因子β； 基質(zhì)金屬蛋白酶； 腎間質(zhì)； 纖維化

腎小管間質(zhì)纖維化是指在各種致病因子如炎癥、損傷等作用下,間質(zhì)細胞及細胞間質(zhì)增多,尤其是基質(zhì)蛋白合成增加,降解受抑制,造成細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)大量堆積導致腎小管間質(zhì)纖維化，腎小管周圍毛細血管堵塞、有效腎單位大量減少、腎小球濾過率也進一步降低[1]。唐云海等[2]發(fā)現(xiàn)山莨菪堿可解除血管痙攣、改善微循環(huán)特點，通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達，改善腎纖維化；王儒柏等[3]報道腎康注射液可改善血循環(huán)、抑制系膜細胞增殖等作用，進而改善腎纖維化。而低分子量肝素(low molecular weight heparin, LMWH)除具有抗凝、抗血栓、改善血循環(huán)作用外，還具有抑制腎小球系膜細胞及基質(zhì)增生的作用[4-5],但是否能改善腎間質(zhì)纖維化方面的報道較少。因此本實驗采用LMWH干預，觀察腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織的損傷指數(shù)及腎組織的TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix Metalloprteinases，MMP-2)表達的影響，探討LMWH的抗腎間質(zhì)纖維化的效應及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠54只，2月齡，體重150～200克，清潔級，由貴州醫(yī)科大學動物部提供。實驗期間自由飲水，攝食飼料為貴陽醫(yī)學院動物中心提供的混合飼料，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。室溫18～28 ℃，相對濕度62%～80%。

1.1.2 主要試劑 低分子量肝素鈣注射液(商品名稱：尤尼舒，海南通用同盟藥業(yè)有限公司 ，批號20060401，國藥準字H20010300)。兔抗鼠TGF-β1(編號BA0290)，兔抗鼠MMP-2(編號BA2200)，生物素標記羊抗兔IgG(編號BA1003)，鏈酶親和素-過氧化物酶復合物(編號SA1082)，封閉用正常山羊血清(編號AR0009)，DAB顯色劑(編號AR1022)，均來自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 健康SD大鼠54只，預養(yǎng)一周后，空腹12 h，隨機分為模型組、LMWH組、假手術(shù)組，每組18只。 模型組及LMWH組采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(unilateral ureteral obstruction,UUO)制作腎間質(zhì)纖維化大鼠模型；假手術(shù)組打開腹腔后分離左側(cè)輸尿管后即關(guān)閉腹腔，LMWH組術(shù)后予LMWH 200 IU/(kg·d)皮下注射。各組大鼠均自由進食。

1.2.2 動物造模 10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠固定，以左側(cè)腹為手術(shù)切口，去毛備皮，打開腹腔暴露左側(cè)輸尿管，在近腎端結(jié)扎兩處，兩結(jié)點中間剪斷輸尿管后縫合，關(guān)閉腹腔。

1.2.3 標本采集及處理 每組分別于手術(shù)后第5天、第10天、第15 天處死6只大鼠，大鼠經(jīng)乙醚麻醉后稱重，腹部作縱形切口，分離出左腎用生理鹽水反復灌洗至發(fā)白，摘除腎臟，剔除包膜，橫斷切取約0.5 cm柱狀體2塊，用于HE染色、Masson染色及免疫組織化學染色，按說明書進行操作。

1.3 觀察指標

1.3.1 腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分 Masson染色后鏡檢,腎小管損害程度在低倍鏡下(×200)依序單盲(觀察者不知標本來源的差異性)觀察左上、右上、左下、右下、中間5個腎間質(zhì)視野，按以下8項指標評分，然后分別計算各個評分的均值，得出腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。腎小管上皮細胞空泡變性：無，0分；輕度局灶變性，1分；中度局灶或輕度彌漫變性，2分；廣泛或彌漫中度以上變性，3分。腎小管擴張：無，0分；輕度(相應視野區(qū)域<25%)，1分；中度(25%～50%)，2分；重度(>50%)，3分。腎小管萎縮：無，0分；輕度(相應視野區(qū)域<25%)，1分；中度(25%～50%)，2分；重度(>50%)，3分。紅細胞管型：無，0分；輕度(偶見)，1分；中度(相應視野內(nèi)<10%的腎小管)，2分；重度(相應視野內(nèi)>10%的腎小管)，3分。蛋白管型：無，0分；輕度(偶見)，1分；中度(相應視野內(nèi)<10%的腎小管)，2分；重度(相應視野內(nèi)>10%的腎小管)，3分。間質(zhì)水腫：無(腎小管間無間隙)，0分；輕度(輕度局灶小管分離)，1分；中度(輕度彌漫或局灶中度腎小管分離)，2分；重度(腎小管重度分離)，3分。間質(zhì)纖維化：無，0分；輕度(相應視野區(qū)域<25%)，1分；中度(25 %～50%)，2分；重度(>50%)，3分。間質(zhì)細胞浸潤：無，0分；輕度(輕度局灶細胞浸潤)，1分；中度(輕度彌漫或局灶中度細胞浸潤)，2分；重度(重度細胞浸潤)，3分。

1.3.2 TGF-β1及MMP-2 水平 細胞胞漿染上棕黃色為陽性細胞，在400倍光鏡(LEICA DM 1 000)下目測5個病變比較明顯的視野并計數(shù)陽性細胞總數(shù)，結(jié)果以陽性細胞數(shù)/HP×400)表示。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

假手術(shù)組：大鼠體重穩(wěn)定，精神狀況良好，毛皮有光澤，動作自如，反應靈敏。模型組：大鼠精神逐漸萎靡、消瘦、反應遲鈍；LMWH組：精神狀況一般，反應靈敏度一般。

2.2 腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分

假手術(shù)組：腎小管結(jié)構(gòu)正常,小管間質(zhì)無增寬，術(shù)后5 d、10 d 、15 d比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組：UUO 術(shù)后 5 d,出現(xiàn)小管間質(zhì)輕度增寬, 伴有少量炎性細胞浸潤及膠原沉積；UUO 術(shù)后 10 d可見腎小管間質(zhì)中度增寬, 腎小管結(jié)構(gòu)破壞,偶有管腔塌陷, 炎性細胞浸潤,膠原成分增加；UUO 術(shù)后15 d可見腎小管間質(zhì)損傷程度明顯，3個時段腎間質(zhì)損傷指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LMWH組：UUO 術(shù)后 5 d, 偶有小管間質(zhì)增寬, 伴有少量炎性細胞浸潤及膠原沉積；UUO 術(shù)后10 d可見腎小管間質(zhì)輕度增寬, 腎小管結(jié)構(gòu)輕度破壞, 管腔無塌陷,少許炎性細胞浸潤,膠原成分輕度增加；UUO 術(shù)后15 d可見腎小管間質(zhì)中度增寬，管腔無塌陷，較多炎性細胞浸潤, 膠原成分較多增加；術(shù)后5 d與10 d腎間質(zhì)損傷指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P=1.0)。LMWH組較同期模型組腎間質(zhì)損傷指數(shù)均減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)

(1)與同期模型組比較，P<0.05；(2)與模型組第5天相比，P<0.05；(3)與模型組第15天相比，P<0.05

2.3 TGF-β1表達情況

假手術(shù)組TGF-β1表達均為陰性，模型組、LMWH組均有陽性表達。模型組隨時間推移TGF-β1表達逐漸增加，各時間段比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術(shù)后10 d 、15 d LMWH組較同期模型組TGF-?表達均減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)TGF-β1表達

(1)與模型組比較，P<0.05;(2)與模型組第5天相比，P<0.05；(3)與模型組第15天相比，P<0.05

2.4 MMP-2表達情況

模型組和LMWH組的大鼠術(shù)后5 d、10 d、15 d的MMP-2陽性表達均較假手術(shù)組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組隨時間推移MMP-2表達逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； LMWH組較同期模型組MMP-2表達均增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腎小管間質(zhì)MMP-2表達

(1)與同期模型組比較，P<0.05;(2)與模型組第5天相比，P<0.05；(3)與模型組第15天相比，P<0.05

3 討論

近年的研究顯示腎小管間質(zhì)病變與慢性腎衰竭進展關(guān)系密切。腎間質(zhì)纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展到后期的病理學特征,是各種慢性腎臟疾病進展為終末期腎功能衰竭的共同通路。腎間質(zhì)纖維化病變過程涉及細胞、細胞因子、ECM、生長因子及它們之間的相互作用[1]。在調(diào)節(jié)因子中, TGF-β1被公認是最主要的前纖維化因子，被譽為發(fā)生纖維化的樞紐[6-7]。作為一種強效的致纖維化因子, TGF-β1在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)起作用。ECM在腎間質(zhì)的過度沉積是引起腎間質(zhì)纖維化的主要原因,ECM的降解由細胞外基質(zhì)降解酶系統(tǒng)介導, 該系統(tǒng)中MMP -2 又稱Ⅳ型膠原酶、明膠酶，屬于中性金屬蛋白酶。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP-2 是非糖基化的蛋白質(zhì)，對MMP-2 有高度親和力，以1∶1的比例與MMP-2 結(jié)合，是MMP-2 的主要抑制劑[8]。正常情況下，MMP-2 /TIMP-2 系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，在病理狀態(tài)下，MMP-2 /TIMP-2 系統(tǒng)的平衡被打破，可能參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程[1, 9-10]。MMP 表達減少，可使膠原降解減少，導致ECM堆積，轉(zhuǎn)向腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化[11]。

本實驗采用大鼠UUO模型，UUO模型是研究腎間質(zhì)纖維化最常用的模型。在UUO模型中發(fā)生腎盂積水、腎間質(zhì)纖維化和細胞凋亡。模型組Masson染色顯示間質(zhì)膠原沉積加重，腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)升高，提示UUO造模成功;術(shù)后5 d、10 d、15 d模型組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義，提示腎小管間質(zhì)損傷逐漸加重。模型組TGF-β1表達漸增強而MMP-2表達漸減少，該結(jié)果與Sommer[12]等報道相符。LMWH是由普通肝素(UFH)酶解或化學降解的方法而得到的,其相對分子質(zhì)量為2 000～10 000,平均為5 000左右的混合物,本實驗中給予LMWH干預治療后發(fā)現(xiàn)術(shù)后5 d、10 d、15 d LMWH組均比同期模型組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)減低，差異有統(tǒng)計學意義，提示LMWH干預可減輕腎小管間質(zhì)纖維化。在LMWH干預后細胞因子TGF-β1、MMP-2表達水平發(fā)生改變，術(shù)后10 d、15 d LMWH組比同期模型組TGF-β1表達減輕而MMP-2表達增強，差異均有統(tǒng)計學意義，提示LMWH可能是通過對TGF-β1、MMP-2表達的影響從而減輕腎間質(zhì)纖維化。機制可能包括：(1)LMWH通過抑制TGF-β1 啟動子和防止核蛋白與調(diào)節(jié)性AP-1 位點結(jié)合，從而抑制TGF-β1表達[13]，而TGF-β1 可通過激活Smad，激活絲裂原活化蛋白酶通路、刺激核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1 的形成等機制降低MMP-2 的表達[14]，因此LMWH可通過抑制TGF-β1的表達間接促進MMP-2的表達，促進ECM降解；(2)LMWH通過促進內(nèi)皮細胞表達細胞外基質(zhì)降解酶t-PA 活性，促進細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，促進ECM降解，抑制腎小管間質(zhì)纖維化[15]；(3)ECM的不同成分上均具有LMWH的結(jié)合位點,因而LMWH可直接參與對ECM的調(diào)控[16]。因為TGF-β1 可通過多種信號途徑促進腎纖維化，除了干預MMP-2的表達外，還通過干預其他信號途徑調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化的進展。因此在本實驗LMWH改善腎小管間質(zhì)纖維化機制中，LMWH對TGF-β1 和MMP-2的干預中哪個起到更關(guān)鍵的作用，目前尚未可知，有待進一步實驗來明確。期待LMWH作為 一種新型抗凝藥物，在延緩腎小管間質(zhì)纖維化的臨床應用中得到更廣泛的研究和使用。

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(2015-06-10收稿，2015-07-21修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 趙 毅

Preventive Effect of Low-Molecular-Weight Heparin on Renal Fibrosis of Mice

LU Tao1, ZHU Chunling2

(1.DepartmentofNephrology,HaiKouPeople'sHospital,Haikou570000,Hainan,China; 2.DepartmentofNephrology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the preventive effect and mechanism of low-molecular-weight heparin on renal fibrosis of mice. Methods: Fifty- four SD mice were randomly divided into 3 groups: Sham-operation group, unilateral ureteral obstruction group (UUO), and LMWH group. The latter two groups adopted UUO to build models, and LMWH group were injected with LMWH after surgery.6 mice of each group were executed randomly on the days 5, 10, 15 after surgery. Immunohistochemistry was performed on obstructed renal tissue to detect TGF-β1 and MMP-2 expression. Histological studies were also performed by HE and Masson staining. Results: The tubulointerstitial damage indexes, the expression of TGF-β1 were significantly higher than that of sham-operation group (P<0.05), the expression of MMP-2 was significantly lower than that of sham-operation group (P<0.05); On 10 d and 15 d after surgery, the tubulointerstitial damage indexes and the expression of TGF-β1 in LMWH group were significantly lower than that of UUO group (P<0.05), the expression of MMP-2 was significantly higher than that of UUO group (P<0.05). Conclusion: LMWH may attenuate development of tubulointerstitial fibrosis by down-regulation the expression of TGF-β1 and up-regulation of the expression of MMP-2 in UUO mice.

heparin, low-molecular-weight; transforming growth factor beta; matrix metalloproteinases; renal interstitium; fibrosis

時間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2314.052.html

R692

A

1000-2707(2015)09-0943-04

*通信作者 E-mail:gyzcl@medmail.com.cn