補體因子D及脂聯素在子癇前期孕婦胎盤組織 血清及尿液中的表達及相關性研究

潘亞萍，漆洪波，羅 欣，劉西茹（重慶醫科大學附屬第一醫院產科，重慶400016）

子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種，指妊娠20周以后出現的以高血壓和蛋白尿為特點的一種全身性疾病，迄今為止仍是我國孕產婦及圍生兒死亡的重要原因。既往研究證實，子癇前期與成人代謝綜合征有諸多共同的病理生理特征，包括脂肪代謝異常、胰島素抵抗和血液高凝狀態，而這些異常狀態可能與脂肪細胞因子的異常分泌相關，包括瘦素、脂聯素（ADPN）、補體因子D（CFD）等[1-2]。子癇前期患者血清中ADPN水平降低，而CFD水平及其與ADPN的關系如何尚不清楚。本研究通過檢測子癇前期孕婦胎盤組織、血清及尿液中CFD以及ADPN的水平，探討其與子癇前期發病的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2014年3～9月在重慶醫科大學附屬第一醫院產科住院行剖宮產術的子癇前期孕婦29例（子癇前期組），診斷標準參照《婦產科學》第8版全國統編教材，以及正常足月妊娠行擇期剖宮產術的孕婦30例（正常妊娠組）為研究對象。兩組均為單胎妊娠；既往無高血壓、心臟病、腎臟病、糖尿病及甲狀腺功能亢進等病史；無復發性自然流產、畸胎、死胎等不良孕產史；無吸煙、長期服用藥物史。孕期無急、慢性感染性疾病；胎兒無畸形。兩組孕婦年齡、體質量指數、孕產次、孕周、新生兒性別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 入院后，于治療及分娩前取孕婦的清潔中段尿4 mL，經4℃低溫離心后將上清液移出。同時抽取孕婦空腹外周肘靜脈血5 mL，離心分離收集血清。血清及尿液樣品均轉入-80℃冰箱保存待測。剖宮產術中胎盤娩出后5 min內，避開肉眼可見的鈣化灶及壞死區，取胎盤母體面中央組織約1.0 cm3大小，PBS漂洗后立即置于液氮中保存，過夜后轉入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 Western blotting檢測胎盤組織CFD、ADPN蛋白的表達 嚴格按照蛋白提取試劑盒（海門碧云天生物技術研究所）說明書提取胎盤組織總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度（南京凱基生物技術研究所）。行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜（美國Millipore公司），置于含5%脫脂奶粉、0.1%吐溫-20的枸櫞酸鹽緩沖液中，室溫封閉1 h后，分別加入兔抗人CFD、ADPN單隆抗體（稀釋濃度分別為 1∶500 和 1∶1 000，美國 Abacm 公司，美國Santa Cruz公司）、兔抗人β-actin單克隆抗體（稀釋濃度為 1∶1000，美國 Santa Cruz公司），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（稀釋濃度為1∶1 000，北京中杉金橋生物技術有限公司）二抗，室溫孵育1 h。加入ECL顯色液（南京凱基生物技術有限公司），利用ChemiDoc XRS化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）檢測蛋白質印跡條帶灰度，用Quantity One 4.6.2版圖像分析軟件進行分析。

1.2.3 血清及尿液中CFD、ADPN水平檢測 采用ELISA分別檢測CFD和ADPN的水平。CFD ELISA檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，ADPN ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物有限公司，操作按說明書進行。所有標本均行3個復孔檢測且為同批測定，取平均值為最終濃度，批內變異小于0.5%。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以ss表示，組間比較采用t檢驗，兩變量之間的相關關系用Spearsman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組孕婦胎盤組織中CFD與ADPN表達水平比較 子癇前期組孕婦胎盤組織中CFD水平較正常妊娠組明顯升高，而ADPN水平顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.05 或 0.01），見圖 1。兩組 Western blotting 結果見圖2。

圖1 兩組蛋白相對表達量比較

圖2 Western blotting結果

2.2 兩組孕婦血清中CFD與ADPN的水平比較 子癇前期組孕婦血清中的CFD水平顯著高于正常妊娠組，而血清中ADPN的水平顯著低于正常妊娠組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 兩組孕婦血清CFD與ADPN水平比較（ss）

表1 兩組孕婦血清CFD與ADPN水平比較（ss）

注：與正常妊娠組比較，aP＜0.05。

組別子癇前期組正常妊娠組n CFD（μg/mL）ADPN（ng/mL）29 30 1.83±0.59a 0.67±0.04 13.16±2.01a 80.68±1.27

2.3 兩組孕婦尿液中CFD與ADPN的水平比較 子癇前期組孕婦尿液中的CFD水平顯著高于正常妊娠組，而ADPN水平顯著低于正常妊娠組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 2。

表2 兩組孕婦尿液中CFD與ADPN水平比較（ss，ng/mL）

表2 兩組孕婦尿液中CFD與ADPN水平比較（ss，ng/mL）

注：與正常妊娠組比較，aP＜0.05。

子癇前期組正常妊娠組ADPN 29 30 174.95±23.61a 43.27±16.59 2.40±0.86a 9.29±1.33

2.4 子癇前期孕婦胎盤組織、血清及尿液中CFD與ADPN的相關性 子癇前期孕婦胎盤組織中，CFD與ADPN 表達水平呈負相關（r=-0.82，P＜0.05），血清中 CFD和 ADPN 呈負相關（r=-0.78，P＜0.05），在尿液中，二者的關系也呈負相關（r=-0.63，P＜0.05）。而在正常妊娠組中，胎盤組織、血清及尿液中的CFD與ADPN水平均無相關性（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 子癇前期與代謝綜合征 代謝綜合征是以中心性肥胖、糖脂代謝紊亂、高血壓為主要臨床特點的一組嚴重影響健康的臨床綜合征，是引發心、腦血管事件的高危因素，也是成人致死和致殘的主要原因[3]。近年來越來越多的證據顯示，子癇前期與代謝綜合征具有密切的關聯，而且二者在發病機制和遠期后遺癥方面都存在明顯的相似性，例如都存在胰島素抵抗、血管內皮功能紊亂、高尿酸血癥、高半胱氨酸血癥及血栓前狀態等[4-5]。因此有學者提出，妊娠期高血壓疾病尤其是子癇前期可稱之為妊娠期代謝綜合征[6]。早期識別妊娠期代謝綜合征有助于定義該類群體，因為這些女性不僅易發展為妊娠相關疾病狀態，例如妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病等，發生不良圍生期結局的風險顯著增高，而且其將來發生代謝性疾病和心血管疾病的危險性也顯著增加[7]。近20年來對糖類及脂肪在妊娠期間代謝機制的傳統觀念正在不斷地被修正，由此發現的一些脂肪因子，如瘦素、抵抗素、ADPN等，證實對妊娠期婦女的糖脂代謝存在不同程度的影響。而這些影響不僅作用于孕婦本身，對胎嬰兒亦具有較大的影響[8]，這也符合“成人疾病胎兒起源學說（DoHAD）”的觀念，亟須引起產科學者重視。

3.2 CFD與子癇前期 CFD又稱為降脂素，是第一個被認識的脂肪分泌蛋白，既往發現其在肥胖的嚙齒類動物中表達降低，但并未引起廣泛關注[9]。CFD是胰凝乳蛋白酶的絲氨酸蛋白酶家族的成員之一，參與調節補體激活的替代途徑的關鍵步驟，并刺激三酰甘油在脂肪細胞中的積累，從而抑制脂肪分解。酰化刺激蛋白作為一種補體蛋白，經酶反應產生，其由脂肪組織分泌，在調節脂肪代謝和能量平衡方面發揮重要作用。一方面提高脂肪細胞捕獲脂肪酸和合成三酰甘油的能力；另一方面通過抑制激素敏感脂酶的活性來抑制三酰甘油的分解。而在其形成過程中需要一種補體成分——CFD的參與[10]。越來越多的研究證實，CFD與肥胖、胰島素抵抗、血脂異常及心血管疾病的發生呈正相關。這與本研究結果類似，在具有胰島素抵抗及血脂代謝異常的子癇前期孕婦的血清及尿液中，CFD的水平顯著高于正常妊娠者，由此提示，CFD的異常表達可能是引發子癇前期一個關鍵環節。

值得關注的是，CFD作為一個新的指標，已經被證實在宮頸鱗癌、胃腸道惡性腫瘤、口腔鱗癌等疾病中存在異常表達[11]。由于胎盤的滋養細胞具有與腫瘤細胞類似的侵襲能力[12]，而本研究顯示，CFD在子癇前期胎盤組織中存在異常的表達升高，因此，CFD是否作用于子癇前期的胎盤滋養細胞，參與調控滋養細胞侵襲能力損傷，從而造成“胎盤淺著床”，最終引發子癇前期，值得進一步研究。

3.3 ADPN與子癇前期 ADPN又稱為ACRP30，是由脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白。ADPN是迄今為止發現的唯一與肥胖呈負相關的細胞因子，有降低三酰甘油和血糖水平、改善胰島素抵抗、保護血管內皮和抑制動脈粥樣硬化等作用[13]。在肥胖者血清中，ADPN水平明顯降低，并且其水平與體質量指數、脂肪百分比、腰臀比有著顯著的相關性[14]。Machado等[15]發現，子癇前期患者血漿中ADPN水平明顯低于正常孕婦，而重度子癇前期降低更明顯，并且血漿ADPN水平與孕婦年齡、孕周、體質量指數、收縮壓和尿蛋白成負相關。而另一項研究也證實，子癇前期患者的胎盤中ADPN及其受體存在異常的表達及調節[16]。本研究結果也表明，ADPN在子癇前期患者的胎盤組織、血清和尿液中的水平明顯下降，與子癇前期的發生密切相關。同時通過相關性分析證實，在子癇前期孕婦的胎盤組織、血清和尿液中的CFD與ADPN水平均呈顯著負相關性，但其具體的調節機制仍不清楚。同時低脂聯素血癥和高降脂素血癥是否能作為敏感的子癇前期危險因子和判斷病情預后的重要指標，還需大樣本的進一步研究。需重點指出的是，由于尿液檢測的方便性和無創性，聯合檢測孕婦尿液中的CFD與ADPN水平，有望成為一種新型、高效的預測早期診斷子癇前期的方法。

子癇前期的發生是一個多因素、分階段動態發展的過程，其發病機制仍未完全闡明，而與糖脂代謝紊亂相關的脂肪細胞因子表達異常可能是導致其發病的重要環節。本研究通過檢測子癇前期及正常晚期妊娠孕婦胎盤組織、血清及尿液中CFD與ADPN水平，初步探討了二者在子癇前期發病中的作用，以期為子癇前期發病機制提供新的靶點和理論依據。同時依據二者在尿液中的異常表達，有望為子癇前期的早發現、早診斷提供新的預警機制。

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