慢性乙型肝炎和原發性肝癌患者體內人腺病毒5型、26型及黑猩猩腺病毒68型中和抗體的流行率

熊域皎，趙啟全，章述軍，黃文祥，周向陽，，賈　蓓△(重慶醫科大學附屬第一醫院感染科，重慶市傳染病寄生蟲病學重點實驗室，重慶40006;Wistar研究所，美國費城904)

慢性乙型肝炎和原發性肝癌患者體內人腺病毒5型、26型及黑猩猩腺病毒68型中和抗體的流行率

熊域皎1，趙啟全1，章述軍1，黃文祥1，周向陽1，2，賈蓓1△
(1重慶醫科大學附屬第一醫院感染科，重慶市傳染病寄生蟲病學重點實驗室，重慶400016;2Wistar研究所，美國費城19104)

［摘要］目的:調查慢性乙型病毒性肝炎( CHB)和原發性肝癌( PLC)患者體內人腺病毒5型( AdHu5)、26 型( AdHu26)和黑猩猩腺病毒68型( AdC68)中和抗體的流行率，為這2種疾病開發安全有效的生物治療載體提供依據。方法:我們收集196份CHB患者的血清和193份PLC患者的血清，通過腺病毒中和實驗檢測血清中AdHu5、AdHu26和AdC68的中和抗體。結果:在CHB患者中AdHu5、AdHu26和AdC68中和抗體的陽性率分別為84. 7%、58. 2%及39. 8%;在PLC患者中AdHu5、AdHu26和AdC68中和抗體的陽性率分別為75. 1%、66. 8%及32. 1%。結論:本次實驗顯示3種腺病毒中和抗體的流行率和抗體滴度都以AdC68的最低，故其作為CHB和PLC的生物治療載體較AdHu5與AdHu26具有優勢。

［關鍵詞］慢性乙型病毒性肝炎;原發性肝癌;腺病毒;中和抗體

目前對于慢性乙型病毒性肝炎( chronic hepatitis B，CHB)的病毒清除和原發性肝癌( primary liver cancer，PLC)的進展控制尚缺乏十分有效的藥物，基因治療和疫苗的開發是近年來關注的重點之一，而攜帶靶向基因的載體是決定效率的重要因素。腺病毒載體具有高效低毒嗜肝性的特性，且肝臟是其基因表達的主要靶向器官，目前廣泛應用于CHB和PLC生物治療，最常用的為人腺病毒5型( human adenovirus type 5，AdHu5) ;然而，腺病毒載體由于其高度的免疫原性，導致在基因治療過程中的作用受到一定限制［1-3］，發現病人或是被接種對象體內已存在有該型腺病毒的中和抗體，會直接清除腺病毒載體及其攜帶的基因，導致得不到預期的表達或是完全不表達，使免疫或治療失敗［4-5］。有大約50多種腺病毒可能感染人類［6］，因此選擇合適的腺病毒載體對提高生物治療和開發高效的疫苗非常必要，選擇不常見的腺病毒血清型［如人腺病毒26型( human adenovirus type 26，AdHu26)］或動物腺病毒血清型［如黑猩猩腺病毒68型( chimpanzee adenovirus type 68，AdC68)］是降低其免疫原性、提高生物治療療效的最新研究方向。既往中國國內研究表明，AdHu5中和抗體在中國人群中存在高流行率，但對AdHu26 和AdC68的研究較少，且沒有對CHB和PLC人群進行相關的研究［7］。因此，我們收集了重慶地區196 份CHB患者血清和193份PLC患者血清進行血清中和實驗，以評估這類人群中AdHu5、AdHu26和AdC68血清中和抗體的流行情況，為相關腺病毒對CHB和PLC的生物治療提供依據。

材料和方法

1材料

1.1主要質粒和細胞AdHu5、AdHu26和AdC68的腺病毒質粒由美國Wistar實驗室惠贈，3種腺病毒都表達綠色熒光蛋白( green fluorescent protein，GFP) ;人腎胚細胞HEK293細胞購自ATCC。

1.2動物SPF級BALB/c小鼠，6～8周齡，體重( 20±4) g，由重慶醫科大學動物實驗中心提供，動物實驗經過重慶醫科大學動物實驗倫理委員會批準。

1.3主要試劑和耗材胎牛血清( Gibco) ; DMEM高糖培養基和胰蛋白酶( HyClone) ;磷酸鈣轉染試劑盒( Invitrogen) ;限制性內切酶Pac I( NEB) ; 96孔板( Corning) ;磷酸鹽緩沖溶液PBS和移液器吸頭(北京鼎國生物技術有限公司)。

2主要方法

2.1血清樣本血清樣本來自于重慶醫科大學附屬第一醫院2010年12月～2011年9月住院患者中的196位CHB患者和193位PLC患者。CHB患者以乙肝兩對半表面抗原陽性，乙肝病史大于1年為標準，患者年齡范圍在17～79歲，男女比例為157∶39; PLC患者以典型的PLC影像學表現和(或)肝組織活檢證實，并排除肝血管瘤和轉移性肝癌為標準，患者的年齡范圍在17～75歲，男女比例為145∶48。收集的血標本離心( 3 000 r/min，5 min)后將上清液標本存于－80℃冰箱。

2.2細胞培養HEK293細胞是含腺病毒E1區的人腎胚細胞系，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，置于37℃5%、CO2培養箱中培養。待細胞達到80%～90%融合后，用胰蛋白酶消化細胞，按1∶3比例進行傳代培養。

2.3重組腺病毒AdHu5、AdHu26和AdC68的腺病毒質粒在HEK293細胞中包裝出病毒后(磷酸鈣轉染法)，并在HEK293細胞中進行大量擴增，再用改良的氯化銫密度梯度離心法純化腺病毒，收集純化腺病毒(濃度約5×1015VP/L，VP即病毒顆粒)保存于－80℃。

2.4陽性對照血清的制備取100 μL濃度為1× 1014VP/L的腺病毒肌注小鼠左后腿肌肉，3周以后同一部位重復注射1次，1周后收集小鼠血清獲得陽性對照，分裝保存于－80℃。每種腺病毒分別注射4只雌性小鼠。

2.5腺病毒中和滴定實驗實驗前將病人血清標本置于56℃恒溫水浴中滅活30 min。在96孔板的第1排孔中加入10 μL的病人血清樣本，并在第1排孔最末2個孔分別加10 μL DMEM高糖培養基和10 μL的小鼠陽性血清(分別作為陰性對照組和陽性對照組)，再每孔加入90 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基在第1排孔，同時其余各孔加入50 μL 的10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。將96孔板第1排孔中吸取50 μL混合液加入對應的第2排孔中，再取50 μL混合液加入第3排孔，以此類推，將患者血清標本從1∶10～1∶1 280進行稀釋(倍比稀釋法)，每個病人血清標本每個稀釋度做2個復孔，最后每孔加入50 μL經方陣滴定實驗篩選出的最佳腺病毒量。將此加樣好的96孔板置于37℃、5% CO2培養箱中培養1 h，再每孔加入50 μL約2. 5×104個HEK293細胞，放回培養箱繼續培養。36 h后取出HEK293細胞置于倒置熒光顯微鏡( Olympus)下觀察結果，與陰性對照組比較，以綠色熒光較陰性對照組下降50%且滴度≥20為陽性結果。以血清樣本稀釋度的倒數作為腺病毒中和抗體的滴度。

3統計學處理

數據經SPSS 19. 0統計軟件進行分析，比較AdHu5、AdHu26和AdC68血清中和抗體的流行率采用χ2檢驗，3種血清型的腺病毒中和抗體滴度的比較運用Friedman檢驗，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1 CHB患者各型腺病毒血清學分析結果

1.1CHB患者中腺病毒中和抗體的流行率196 名CHB患者中AdHu5中和抗體陽性率高達84. 7%，AdHu26中和抗體陽性率為58. 2%，AdC68中和抗體陽性率為39. 8%。AdHu5中和抗體陽性率顯著高于AdHu26，AdHu26中和抗體陽性率顯著高于AdC68( P＜0. 05)，見表1。

表1　腺病毒AdHu5、AdHu26和AdC68在CHB和PLC患者中的中和抗體陽性率Table 1.Seroprevalence of AdHu5，AdHu26 and AdC68 neutralizing antibodies in CHB and PLC patients

1.2CHB患者中AdHu5、AdHu26和AdC68的中和抗體滴度的分布情況在CHB患者中AdHu5顯示出高滴度的中和抗體，其中中和抗體滴度在1 280及以上占46. 4%，而AdHu26中和抗體滴度≥1 280的僅占11. 2%; AdC68中和抗體滴度集中在20～160，占陽性者的97. 4%，中和抗體滴度在1 280及以上的占陽性者的0. 05%，顯示出低滴度流行，見圖1。

Figure 1.Distribution of AdHu5，AdHu26 and AdC68 neutralizing antibody titers in CHB and PLC patients.圖1　腺病毒AdHu5、AdHu26和AdC68的中和抗體滴度在CHB和PLC患者中的分布

1.3CHB患者中腺病毒中和抗體在不同年齡和性別中的分布情況在表2中可以看出，CHB患者3種腺病毒中和抗體陽性率在各個年齡組之間沒有明顯區別，沒有隨著年齡增長的趨勢( P＞0. 05)。CHB患者的男女比例為157∶39，3種腺病毒中和抗體流行率在男女性別之間沒有顯著差異( P＞0. 05)，見表3。

表2　腺病毒AdHu5、AdHu26和AdC68在CHB和PLC患者中的不同年齡組的中和抗體陽性率Table 2.Seroprevalence of AdHu5，AdHu26 and AdC68 neutralizing antibodies in different age groups of CHB and PLC patients( %)

表3　腺病毒AdHu5、AdHu26和AdC68在CHB和PLC男女患者中的中和抗體陽性率Table 3.Seroprevalence of AdHu5，AdHu26 and AdC68 neutralizing antibodies between male and female ( %)

2 PLC患者中各型腺病毒的血清學分析結果

2.1PLC患者中腺病毒中和抗體的流行率193名PLC患者中AdHu5中和抗體陽性率高達75. 1%，AdHu26中和抗體陽性率為66. 8%，AdC68中和抗體陽性率為32. 1%。AdHu5的中和抗體陽性率與AdHu26的中和抗體陽性率沒有顯著差別( P＞0. 05)，AdHu5和AdHu26中和抗體陽性率顯著高于AdC68( P＜0. 05)，見表1。

2.2PLC患者中AdHu5、AdHu26和AdC68的中和抗體滴度的分布情況在193名PLC患者中，AdHu5仍顯示出高滴度的中和抗體，中和抗體滴度≥1 280的占19. 7%，明顯高于AdHu26在該范圍的比例; AdHu26的中和抗體滴度在20～160居多; AdC68中和抗體滴度＜20的占67. 9%，其中中和抗體滴度在20～160的占32. 1%，≥1 280的沒有檢測到，顯示出低滴度流行，見圖1。

2.3PLC患者中腺病毒中和抗體在不同年齡組和性別中的分布情況在表2中可以看出，PLC患者中3種腺病毒中和抗體陽性率在各個年齡組之間沒有明顯區別，沒有隨著年齡增長的趨勢。PLC患者的男女比例為145∶48。3種腺病毒中和抗體在男女間的流行率沒有顯著差異( P＞0. 05)，見表3。

討論

我國是CHB高度流行區，其是導致PLC的首位原因;肝細胞肝癌是常見的嚴重影響身體健康的惡性腫瘤，我國肝癌患病率高，據統計，全球半數以上肝癌患者來自我國［8-10］。目前對其具有前景的一種治療手段是應用腺病毒載體進行基因治療和疫苗開發。腺病毒載體宿主細胞范圍廣泛，既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞，容易制備高滴度病毒粒子;而且在受染細胞內不發生整合，因此沒有致癌和致突變的危險，并可插人大片段的外源基因，是生物治療的理想載體［11-13］。但由于人類在幼年時期普遍感染過腺病毒AdHu5，進入人體會產生高滴度的中和抗體，導致其攜帶的基因表達下降，且應用時需要短期重復注射，也造成毒性增加。AdHu5的高流行率使其不適用于基因治療，策略包括尋找在人群中具有低流行率的血清型的腺病毒或者改造AdHu5的表殼結構。

為使以腺病毒為載體的疫苗或基因治療能最大限度地發揮作用，了解腺病毒中和抗體在該人群中的分布情況及其滴度是有效治療的基礎，血清中和試驗檢測特定血清型病毒的中和抗體存在情況，是目前可利用的血清學方法中較客觀的一種途徑［7］。

本次研究的196位CHB患者和193位PLC患者中，CHB患者男女比例為157∶39，PLC患者男女比例為145∶48，這可能與男性較女性更易得肝病有關，但無論CHB還是PLC病人的年齡和性別的差異并不影響各型腺病毒的血清中和抗體流行率的高低，這與在中國健康人群中的研究結果一致。AdHu5和不常見的人腺病毒AdHu26、黑猩猩腺病毒AdC68在CHB患者和PLC患者人群中的免疫趨勢與健康普通人群也是一致的，其中AdHu5的流行率最高，但AdHu26流行率較中國健康人群和以往其余地方的的調查結果高［14］，AdC68在重慶地區CHB和PLC患者中的流行率也明顯高于中國健康人群的結果，而且AdHu5、AdHu26和AdC68在CHB患者和PLC患者人群中的流行率都比重慶地區的健康人群高［15］，這是否由于肝病患者免疫功能的紊亂對腺病毒易感性增強，血清學反應異于健康人或者肝炎病毒與這幾型腺病毒有交叉反應，尚有待于進一步研究。我們曾經對來自新疆的HIV高危人群進行AdHu5、AdHu26和AdC68腺病毒血清型的檢測，也發現AdHu26和AdC68血清中和抗體的陽性率顯著高于普通健康人群水平。盡管在CHB和PLC人群中總的抗體水平較高，但AdHu26和AdC68以低抗體滴度水平存在，高滴度水平相當低，尤其是AdC68，其最早成功應用于狂犬病毒的疫苗制備，具有低毒和優秀的免疫效果，AdC68的健康人群血清流行率在歐美和東南亞地區很低，而在非洲地區差異較大［16］，盡管在重慶地區CHB和PLC人群中的流行率顯著高于其他國家地區，但大部分抗體滴度水平在20～160，因此作為載體應用其效率遠優于AdHu5，當然由于其來自動物，安全性尚待進一步驗證。

本實驗對重慶地區的CHB和PLC患者的人及黑猩猩腺病毒的血清流行率進行分析，結果表明AdHu5在該人群中有很高的流行率，如果不對其進行如表殼改造而用于基因治療將可能導致治療的失敗;而AdHu26是最新開發的一種人腺病毒載體，但可惜也有很高的中和抗體流行率，不足以代替AdHu5，黑猩猩腺病毒AdC68用于CHB和PLC的基因治療可能會有很好的前景。

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Seroprevalence of neutralizing antibodies to human adenovirus type 5，human adenovirus type 26 and chimpanzee adenovirus type 68 in patients with chronic hepatitis B and patients with primary liver cancer

XIONG Yu-jiao1，ZHAO Qi-quan1，ZHANG Shu-jun1，HUANG Wen-xiang1，ZHOU Xiang-yang1，2，JIA Bei1
(1Department of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing Key Laboratory of Infectious Diseases and Parasitic Diseases，Chongqing 400016，China;2The Wistar Institute，Philadelphia 19104，USA.E-mail: beija7410@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the seroprevalence of neutralizing antibodies to human adenovirus type 5 ( AdHu5)，human adenovirus type 26 ( AdHu26) and chimpanzee adenovirus type 68 ( AdC68) in the patients with chronic hepatitis B ( CHB) and the patients with primary liver cancer ( PLC)，and to provide guidance for developing safe and effective biotherapy vectors against CHB and PLC.METHODS: The blood samples from 196 patients with CHB and 193 patients with PLC were examined to assess the presence of neutralizing antibodies against AdHu5，AdHu26 and AdC68 by adenovirus neutralization assays.RESULTS: The seroprevalence rates of neutralizing antibodies to AdHu5，AdHu26 and AdC68 in the CHB patients were 84. 7%，58. 2% and 39. 8%，respectively.Among the patients with PLC，the prevalence rates of neutralizing antibodies were as follows: AdHu5，75. 1%; AdHu26，66. 8%; AdC68，32. 1%.CONCLUSION: The prevalence rates and titers of neutralizing antibodies against AdC68 were the lowest among the 3 adenoviruses.Therefore，AdC68 serves as more suitable biological therapy vectors for CHB and PLC than AdHu5 and AdHu26.

［KEY WORDS］Chronic hepatitis B; Primary liver cancer; Adenoviruses; Neutralizing antibodies

通訊作者△Tel: 023-89012430; E-mail: beijia7410@163.com

［收稿日期］2015-02-06［修回日期］2015-04-10

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1272-05

［中圖分類號］R511. 8; R181. 32

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.021