紅細胞滲透脆性試驗結果判斷改良方法介紹

高麗 張麗霞 張杰

紅細胞滲透脆性試驗(OFT)可以評價紅細胞在低滲氯化鈉溶液中的耐受能力，是檢測患者紅細胞膜是否有缺陷的經典方法。該方法簡便易操作，可作為臨床某些溶血性疾病，如遺傳性球形紅細胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血和遺傳性橢圓形細胞增多癥等的初篩診斷［1］。

OFT為手工測定方法，判定其結果的溶血情況多采用目測觀察，檢測人員的主觀判斷和不同工作經驗人員的判讀都會導致人為因素的偏差，結果可能會影響臨床的診斷。另一方面，目測法僅能觀察到溶血的大致情況，不能量化評判紅細胞破裂的程度，缺乏客觀的依據。

本試驗采用分光光度法測定紅細胞在低滲氯化鈉溶液中的溶血情況，制定紅細胞滲透脆性溶血曲線，量化了溶血程度，改良了OFT的結果判斷方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集20例健康對照者肝素鋰抗凝靜脈血5 ml，年齡28～56歲，平均(42±8.17)歲，男女各10例;8例缺鐵性貧血患者肝素鋰抗凝靜脈血5 ml，年齡22～58歲，平均(40.75±12.36)歲，男女各4例;8例球形紅細胞增多患者肝素鋰抗凝靜脈血5 ml，年齡26～60歲，平均(42.25±12.42)歲，男女各4例。實驗室自配0.17 mol/L氯化鈉(NaCl)溶液，721分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 方法 參照第3版操作規程將0.17 mol/L NaCl溶液對半稀釋為0.085 mol/L標準品，與蒸餾水按比例配成12管不同濃度 NaCl溶液［2］，見表1。用滴管吸取肝素抗凝血，每管內滴加1滴全血，以旋轉法輕輕混勻。12支小試管加完樣后，500 r/min離心10 min，小心取出試管，輕輕吸取上層液體，置721分光光度計，讀取 A540nm吸光度值［3］。以12號試管為100%溶血對照管，按照公式:溶血率(%)=待測管A540nm/溶血對照管A540nm×100%，計算出其余11管的不同溶血率。正常對照和待測患者的樣本均按上述步驟進行檢測，并分別計算出溶血率。

2 結果

2.1 正常對照組溶血率參考區域的建立 20例健康對照組，按操作步驟，每管NaCl濃度下可得20個溶血率。匯總后統計出每管濃度下的5%和95%分位數的溶血率值，建立并繪制出正常對照溶血率參考區域(圖1)，灰色區域即為正常參考值區域，分布形態類似倒S型，有2個溶血率緩慢變化區段(0.28%～0.36%和0.44% ～0.50%)和1個急速變化區段(0.36% ～0.44%)。

2.2 室內質控溶血率曲線 每批檢測內再以當日選定的健康對照組作為室內質控，按操作步驟，計算出每管溶血率，繪制室內質控曲線(圖2)，健康對照者的溶血率曲線分布在正常參考區域內(圖中灰色區域)。

表1 不同濃度梯度的NaCl溶液

2.3 待測樣本的溶血率曲線 缺鐵性貧血和球形紅細胞增多癥患者的樣本，以正常對照12號試管為100%溶血管對照，計算相應待測樣本的溶血率，繪制出待測患者溶血率曲線(圖2)，圖2中所示1例缺鐵性貧血患者的溶血率曲線分布在正常參考區域下方，1例球形紅細胞增多患者的溶血率曲線分布在正常參考區域上方。

圖1 正常對照溶血率參考區域

圖2 缺鐵性貧血、球形紅細胞增多癥及室內質控溶血率曲線

2.4 結果判斷

2.4.1 室內質控溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區域內，則本次試驗結果可信。

2.4.2 患者紅細胞滲透脆性溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區域內，則判定為紅細胞滲透脆性正常;分布于正常對照溶血率參考區域下方，則判定為紅細胞滲透脆性減低;分布于正常對照溶血率參考區域上方，則判定為紅細胞滲透脆性增加。

2.4.3 缺鐵性貧血的患者溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區域下方，紅細胞滲透脆性減低;球形紅細胞增多患者溶血率曲線分布于正常對照溶血率參考區域上方，紅細胞滲透脆性增加。

3 討論

3.1 傳統試驗的不足 OFT是衡量紅細胞膜對低滲鹽溶液抵抗力大小的經典試驗，可用于有效篩查遺傳性球形紅細胞增多癥及地中海貧血等疾病。正常紅細胞在一定濃度的低滲鹽溶液中，會發生破裂而釋放出血紅蛋白，經過一定時間的靜置后，溶血現象就能在上清液被觀察到。因此，目測法是目前唯一結果判定方法。然而，從目測法判定完全溶血、不完全溶血和不溶血3種狀態，人員間比對相差較大，主觀性較強，需要長期試驗經驗的積累，試驗的有效性和可控性不理想。

3.2 改良溶血率曲線的可行性 傳統OFT結果判讀時，目測待測樣本的開始溶血管和完全溶血管的NaCl濃度，再通過與正常對照樣本的比較，若濃度相差達0.04%，則再推斷患者的紅細胞滲透脆性是否增加或降低。利用溶血率曲線法配合正常參考區域，對缺鐵性貧血和球形紅細胞增多患者樣本的檢驗結果，與其臨床診斷相符，也與傳統試驗方法相一致，因此驗證了該方法的可行性。通過待測樣本紅細胞滲透脆性溶血率曲線與正常對照溶血率參考區間范圍的位置關系，判定紅細胞滲透脆性的情況。紅細胞膜的脆性減低，則溶血率相對于對照就會降低，溶血率曲線就會整體下移，即會位于正常對照溶血率參考區域的下方;反之，則為紅細胞膜的脆性增高的情況。量化的溶血判斷，加上正常對照參考區域，使得OFT脫離了主觀目測法，客觀判定待測樣本的紅細胞滲透脆性，為該方法的臨床應用提供了可靠的依據。

3.3 改良溶血率曲線法的優點 利用分光光度法的改進實驗已有報道［4］，但僅限于實驗教學，尚無臨床應用。另有報道也提出了溶血指數的概念［5］，但未對結果分析而且較為復雜。本文根據吸光度值計算出溶血率，再基于多次平行實驗，采用95%可信區間的統計分析方法，構建了正常對照溶血率參考區域，使得溶血結果的判斷有數可依，有據可循。正常參考區域的確立，使得待測樣本的結果判定更直觀。同時，基于實驗室自建的參考區域，在批內以正常對照樣本作為室內質控，提升了試驗結果的可信性，也可作為不同批次試劑間的比對平臺，這對于解決手工類項目一貫缺乏有效質控的問題，無疑提供了一個新思路。

［1］陳方平.臨床檢驗血液學［M］.北京:高等教育出版社，2006:127.

［2］葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程［M］.3版，南京:東南大學出版社，2007:168-169.

［3］阮萍，黃耀熊，李丹.新型快速顯微多道分光光度技術對血紅蛋白的光譜分析［J］.光譜學與光譜分析，2005，25(7):1121-1124.

［4］黃艷紅，羅自強，秦曉群，等.利用改進的紅細胞滲透脆性實驗加強學生能力培養［J］.醫學教育探索，2009，8(10):1226-1227.

［5］袁明生，易旺云，黃文東.溶血指數測紅細胞滲透脆性的建立及在β-地中海貧血孕婦篩查中的應用［J］.中國優生與遺傳雜志，2010，18(1):60，117.