細胞受控組裝人工喉軟骨支架及性能表征

摘要：目的 應用組織工程和生物制造工程原理，采用增材制造技術，探索一種制造喉關節軟骨支架的新途徑。方法 利用明膠和海藻酸鈉作為材料，通過CCA-II細胞受控組裝機制備喉軟骨支架，然后對所制備支架進行性能的表征。結果 制取出了粘度合適、降解率合適、高孔隙率和含水量的三維支架，類似喉軟骨外基質成分。結論 增材制造技術與組織工程技術和生物制造技術的結合為未來修復喉功能提供一種潛在的手段。

關鍵詞：人工喉軟骨；增材制造；細胞受控組裝；生物3D打印

1喉軟骨支架制備方案

所謂組織工程就是運用工程科學和生命科學的原理和方法，從根本上認識正常和病理的組織結構--功能關系，研究和開發一套具有生物相容性、組織相容性和生物活性的組織器官[1-3]，用以替代或修復已損傷的人體組織和器官，或進一步改進受損組織器官的生理功能。具體做法是：首先制備具有良好生物相容性和良好機械性能的生物材料支架，然后將種子細胞與生物材料支架混合培養，植入受損部位，待細胞生長、增殖、分化形成與原來組織器官具有相同形態，并且具有和原來組織器官相一致的生理功能的具有生物活性的組織器官替代物，同時生物材料支架也按照細胞生長、增殖、分化相匹配的速率降解，從而達到組織器官損傷修復和恢復其生理功能的目的[4-7]。

通過組織工程和生物3D打印技術原理，本文研究過程主要為以下內容：喉軟骨支架的生物材料的選擇和喉軟骨支架的制取。其中主要為降解率合適、孔隙率高、含水率高且生物相容性好的喉軟骨支架。支架組裝過程如圖1所示，支架制取實驗在CCA-II細胞受控組裝機中完成。

2喉軟骨組織工程支架材料的選取

2.1喉的組成成分 成人的軟骨，根據軟骨組織內所含纖維的成分不同，可分為三種類型，即透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨。而喉的軟骨屬于透明軟骨，是一種自身沒有血管，沒有神經，沒有淋巴組織的特殊結構。在透明軟骨中軟骨細胞僅占軟骨組織體積的1～5%。軟骨細胞的營養都是由軟骨基質來提供的。軟骨細胞是一群比較特殊的細胞同時自身能夠合成和維持軟骨基質的底層結構[8]。因此，如何選取合適的支架材料對整個喉軟骨的作用至關重要。

2.2材料的選取 根據喉軟骨組織的組成成分以及其結構特點，理想的喉軟骨組織工程支架應該具備以下特征：①良好的生物相容性，對細胞和機體無毒害；②良好的生物降解特性，可完全被機體降解吸收或排出體外；③良好的機械特性，具備一定的力學強度和可塑性，結構長時間保持穩定，具有較高的孔隙率；④良好的表面相容性，利于細胞在材料表面黏附與生長[9]。目前可作為喉軟骨組織工程支架的材料具體可分為三類，分別為天然高分子材料、人工合成高分子材料以及復合材料。天然高分子材料如膠原、殼聚糖等均取自天然動植物體，其都是軟骨細胞外基質成分或類似基質構成物，所以此類材料能夠很好的與生物體相容，有良好的仿生性和組織親和性，并能夠促進細胞的增殖，且大多來源豐富，價格低，但也有質地相對較軟，機械強度不足的缺點。而合成材料則是在天然材料的基礎上發展起來的，雖然在機械強度上能夠滿足需求，但其親水性差、細胞吸附力弱則是其與天然高分子材料相比不足之處。而復合材料的出現則改變了上述兩種材料的不完美，它即具備了天然材料組織相容性和親和性好的優點，又提高了材料的機械強度，使得喉軟骨組織工程支架的材料變得更具可行性。

根據復合材料的這些優點，本文采取制備明膠與海藻酸鈉復合材料的方法來喉軟骨組織工程支架，其中明膠是膠原的部分變性衍生物，在35℃以下時形成熱可逆性凝膠，具有高含水率及溫敏性[10]。海藻酸鹽可在Ca2+、Ba2+等二價陽離子的作用下發生溶膠凝膠相轉變，具有良好的機械強度和成形性。將二者相結合，得到含水率高、易于成形的明膠海藻酸鈉復合材料（GSA），在化學成分、柔軟性、對親水性營養和代謝物擴散性等方面都與ECMs相似[10]，可用作基質材料。其次，該材料模仿天然軟骨的蛋白多糖水凝膠基質（含水85%～90%），可以作為喉軟骨的修復或替代材料。最后，該材料是由親水性聚合物經水溶脹形成的，軟骨細胞可滲透入其中進行生長。將該材料制成多孔狀，軟骨細胞還可由微孔進入多孔水凝膠內部生長[11，12]。

3支架的制取實驗

本實驗在CCA-II細胞受控組裝機中完成。首先把經Mimics處理過的STL格式三維模型導入計算機中，再用Aurora軟件對該模型分層，得到CLI文件。將得到的CLI文件導入Cark軟件中，準備Cark控制軟件來完成對組裝機進行控制。設定系統組裝參數如表1所示，實驗前設定組裝機溫度在10℃，預冷30min。具體過程如下：①首先分別稱量濃度為20%的明膠溶液以及濃度為4%的海藻酸鈉溶液；②將稱量好的明膠與海藻酸鈉加入0.9%生理鹽水中制作成相應濃度的共混液，并在65℃水浴鍋中加熱30min，邊加熱加用玻璃棒攪拌；③將海藻酸鈉溶液用CJJ78-1磁力加熱攪拌器在65℃恒溫下攪拌1～2h，至海藻酸鈉形成透明均勻膠狀體；④把制作好的海藻酸鈉溶液與明膠溶液按1：1混合，放入1000r/min離心機中離心10min，以去除溶液混合中產生的氣泡；⑤裝入細胞組裝機中打印。

支架制作完成后，滴加6%CaCl2交聯，大約交聯10min左右交聯完成，用PBS清洗兩次，得到成形支架，見圖2。

4 支架的性能表征

根據組織工程支架用于制取喉軟骨基質的要求，支架需要滿足高含水量、有一定降解速率、高孔隙率以及膨脹率在一定范圍內等要求，為此對支架的降解率、孔隙率、含水量以及膨脹率進行表征。

支架的的降解率是組織工程支架重要的參數，本文利用測定支架的失重率來測量支架的降解率[13]，具體的過程是：首先將打印好的12個支架兩兩分成一組，取各組平均質量，記為m1，加入PBS緩沖液中，保證支架完全浸泡在溶液中，放入37℃恒溫培養箱中；每周定期更換PBS溶液，分別于第1，2，3，4，5，6w取一組樣品，用去離子水沖洗多次，稱重，取兩個樣品的平均質量記為m2，按照下列公式來計算支架的降解率：

β = （m1-m2）/m1×100%

支架孔隙率采用排液法測定[14]，選擇所用的液體為乙醇，因其能夠很好地浸泡支架而不使支架溶解、膨脹或收縮。過程為：首先將支架真空干燥8h，稱重，記為m1；然后將干燥后的支架放入具有一定量乙醇的容器中，反復抽真空至支架不再有氣泡溢出，將浸泡在乙醇中的支架連同容器一起稱重，記為m2；最后將內部還含有乙醇的支架從容器中取出，把不含支架的乙醇同容器稱重，記為m3。計算孔隙率的公式如下：

η =v1/（v2+v3）=（m2-m3-m1）/（m2-m3）×100%

其中，v1表示支架中孔隙所占有的體積；v2表示支架中材料的體積；v3表示樣品的總體積。

支架的含水量即支架內水分的含量，具體測定過程為：首先將制備好的支架樣品浸泡在PBS緩沖液中，放入37℃恒溫培養箱中24h，取出濾紙吸取表面多余水分，稱量支架質量，記為m1；然后對支架進行真空干燥8h，稱取干燥后支架質量，記為m2，支架的含水量用以下公式計算[15]：

ɑ=（m2-m1）/m2×100%

最后，對支架的膨脹率進行了測量，具體過程為：首先將支架放入PBS中，然后放入37℃恒溫培養箱中24h；24h后稱取支架體積與質量，分別為V1與m1；再將支架放入低溫冰箱中冷凍12h，凍干后得到固體凝膠支架，稱重，記為m2。利用公式計算支架膨脹率：

Vpbs =（m2-m1）/ρpbs

θ =Vpbs/V1×100%

5結果

由圖3所示，支架的降解率在2w內降解率在14%左右，而且其降解率是呈直線上升，到第6w時支架重量下降到一半以上。根據組織工程支架對材料降解性的要求，需要支架能夠在2w內保持其結構及形狀的穩定，以便支架能夠在體外進行培養，本文所研究明膠-海藻酸鈉支架在2w內只下降14%，能夠為軟骨細胞的黏附、生長及增殖提供充足的時間和空間，而且材料到第6w降解到其自身50%左右，其時間與軟骨細胞的增殖及分泌外基質的速率相匹配，滿足組織工程支架對喉軟骨修復所要求的降解率。不僅如此，當支架植入生物體內時，由于體內含大量對材料有酶性催化作用的物質，會導致材料在體內產生水解及氧化，而明膠在體內水解后肽鍵斷裂，變成低分子多肽，低分子多肽仍能促進細胞增殖及增加細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白[16]。因此，明膠-海藻酸鈉支架的降解率及降解產物的無毒性能滿足喉軟骨的體外增殖與分化。

支架的孔隙率及含水量是對于細胞在支架內部傳輸營養物質和代謝產物的排出中起著重要作用，由表2看出，支架的孔隙率及含水量均達到80%以上，有利于促進細胞代謝及加速營養物質的傳輸，特別是支架模擬天然軟骨的蛋白多糖水凝膠基質含水量在85～90%之間，為軟骨細胞提供類似細胞外基質環境，能夠為細胞的生長與增殖起到比較好的保護和促進作用。表2中還對支架膨脹率進行了測定，由于材料含水量比較高，因此，支架的膨脹率相對較大，但由于材料本身是含水的，本文測定的膨脹率是相對于干燥支架材料而言，實際的膨脹率遠遠小于這個數值，能夠滿足組織工程支架對維持支架結構穩定的要求。

6結論

本文從組織工程學出發，利用當今比較流行的增材制造技術，結合實驗室現有的CCA-II細胞受控組裝機，試圖找到一個新的修復喉關節，尤其是喉軟骨缺損的方法，本文通過細胞受控組裝系統，對不同明膠濃度的實驗，研究出了比較適合制作支架的明膠與海藻酸鈉濃度，實現了細胞支架的打印，說明了明膠-海藻酸鈉支架有高孔隙率與含水量以及比較合適的生物降解性，是作為喉軟骨基質的很好的材料，尤其作為多孔支架，有利于細胞粘附及生長。本文的研究為后面需要做相關支架植入動物體內提供較好的參考，為整個喉支架的制作及動物實驗做了很好的鋪墊。雖然本文初步證實了明膠與海藻酸鈉混合材料作為喉軟骨支架的可行性，但與實際喉軟骨有一定的差距，因此，在不斷研究出新材料的基礎上，選擇怎樣的交聯方法以及制備工藝將會是今后的研究方向。

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