肺癌細胞A549 Livin基因在常見化療藥物作用下的表達和對細胞增殖的影響

摘要：目的 研究化療藥物對人肺細胞癌A549抑制基因Livin基因的影響。方法 將不同化療藥物濃度按100、50、25、12.5、6.25、、3.13、1.56、0.78ug/ml，與A549共同培養，分別作用24、48、72h，MTT檢測細胞凋亡結果；real time PCR檢測Livin mRNA的表達，以及Western blots檢測Livin蛋白的變化。結果 不同濃度化療藥物與A549培養后，細胞凋亡率與化療的濃度增加而升高以及Livin基因的表達也明顯的改變（P<0.01）。結論 化療藥物通過抑制肺癌細胞A549 Livin基因表達，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

關鍵詞：化療藥物；肺癌細胞；Livin基因

隨著吸煙人群的增加（包括吸入二手煙）及大氣污染的加重，肺惡性腫瘤的發病率逐年增加；治療目前除手術切除外，主要為化療與放療，但化療藥物的耐受性往往影響化療藥物的療效；目前研究發現Livin基因與腫瘤的耐受性有一定的關系[1，2]，因此，我們選用常見的化療藥物作用于肺癌細胞株，觀察Livin基因表達的改變，探討Livin基因與細胞凋亡的相互關系。

1資料與方法

1.1一般資料 江蘇省無錫市人民醫院腫瘤科提供化療藥物依托鉑苷、卡鉑、多柔比星。中科院上海生化與細胞生物學研究所提供人肺癌細胞株（A549）。

1.2實驗用儀器與試劑 96孔細胞培養板（Costar， Denmark）；細胞培養箱（NAPCO，USA）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，JAPAN）。DMEM培養基（GIBCO，USA）（每L含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg，青霉素100U、鏈霉素100U、pH7.4）；胰蛋白酶（MERCK，USA）；二甲基亞砜（DMSO）（Merck，Germany），無水乙醇（分析純，上海振興化學試劑廠，批號：20021200365）；Livin（abcam USA）、碘化丙啶（PI） （Sigma，USA），南京生物工程公司提供引物。

1.3 方法

1.3.1體外培養實驗用細胞株 用含10%小牛血清的DMEM培養液培養、傳代人肺癌細胞株（A549）。

1.3.2 實驗分組 正常對照組；依托鉑苷、卡鉑、多柔比星濃度按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78ug/ml，與A549共同培養，分別作用24、48、72h。

1.3.3 MTT法檢測化療藥物對細胞活力的影響 使用0.25%胰酶消化培養至第3代的各組A549細胞后，吹制成單個細胞懸液（細胞密度為1.0×104），分別接種到96孔板中（不含細胞的血清（為消除血清物質對光吸收值的影響）（1～2列）、空白組細胞懸液（3～4列）；模型組細胞懸液（5～6列）；不同濃度的測試藥物組細胞懸液（7～12列）），于37℃、5%二氧化碳的培養箱放置并作用24h、48h、72h后，每孔再加入MTT溶液20ul，繼續孵育4h后終止培養。小心吸棄上清液，小孔加入DMSO 200μl溶解結晶物并振蕩10min后在酶標儀上測定各孔的吸光值。

1.3.4 RT-PCR 檢測Livin mRNA的表達 根據美國NCBI 的Genbank 提供的Livin 和β-actin mRNA 序列， 設計引物序列如下： ①LivinSense： 5′-TGAGGAGTTGCGTCTGGC-3′；Antisense： 5′-GGCTGCGTCTTCCGGTTC-3′。②β-actin（BC004251） Sense： 5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′； Antisense： 5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR應體系均為15ul，其中含cDNA模板2.5ul，SYBR Green 7.5ul，引物 0.6ul，去離子水4.4ul，95℃預變性5min，94 ℃45sec，56℃45sec，72 ℃50sec，35個循環；比較Ct法（△△Ct法）分析結果。

1.3.5蛋白印跡（Western blots） 分析 常規細胞蛋白質的提取、定量， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。濕轉法轉膜后先后與5%BSA、一抗（濃度1∶1 000）、過氧化物酶偶聯的二抗（濃度1∶10 000） 孵育， 運用ECF化學發光顯影、熒光圖像掃描儀掃描存入電腦。

1.4數據分析 運用SPSS13.5統計軟件，以均數±標準差表示，采用單因素方差分析及t檢驗。

2結果

2.1對A549細胞凋亡的改變 實驗結果提示，A549細胞經化療藥物作用后，細胞的抑制明顯增高（P<0.01），并有劑量依賴性以及時間依賴性（見圖1～圖3）。

2.2各化療藥物組細胞Livin mRNA的表達 RT-PCR結果顯示，化療藥物多柔比星、卡鉑與A549細胞分別作用24h、48h后，Livin 基因表達量呈逐漸下降趨勢， 且濃度越高， 時間越長， 則表達量越少；72h后 Livin基因的表達量有增高趨勢；而依托鉑苷分別作用24、48、72h后， Livin 基因的表達量均呈逐漸下降趨勢， 且其幅度隨藥物濃度的增加而增加（圖4）。

2.3各化療藥物對A549細胞的Livin蛋白的影響 化療藥物采用IC50 的抑制濃度， 分別作用于A549細胞 24h、48h、72 h。化療藥物多柔比星、卡鉑作用細胞24h、48h，Livin 蛋白表達量呈逐漸下降；72h Livin蛋白表達量有增高趨勢；依托鉑苷作用72 h 后， Livin 蛋白的表達均逐漸下降， 且其幅度隨藥物濃度的增加而增加（圖5）。

3討論

肺癌目前是全世界腫瘤死亡原因的第一位。近年來，認識到大多數化療藥物是通過誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的增殖而實現治療作用。Livin 基因位于染色體20q13.3， 全長46 kb， 包含7 個外顯子和6 個內含子，它有兩種異構體：Livinα 和Livinβ。Livin 基因在胎盤和發育中的組織以及黑色素瘤、白血病、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌等一些腫瘤組織中特異性高表達， 而在大多數正常組織中不表達或僅有少量表達[3，4]，并且有研究認為，癌癥患者放化療的耐藥與Livin基因的表達水平有關[5]。Livin基因可以通過抗死亡受體途徑、抗線粒體途徑和激活JNK1 信號轉導等途徑發揮抑制細胞凋亡和抵抗腫瘤放化療作用[6]。

實驗結果顯示，A549經化療藥物多柔比星、卡鉑作用后，Livin基因表達初期呈降低， 但隨化療藥物作用時間的增加，Livin基因表達呈明顯上升；Livin基因早期不僅通過與procaspase-9直接結合抑制其活性，還可以通過抑制caspase-3 的活性， 阻斷其對procaspase-9 的正反饋激活，從而介導細胞凋亡通路；此外后期Livin基因作為一種酶抑制劑，通過BIR -結構域結合凋亡過程中激活的核心物質Caspases蛋白（如Caspase-3、Caspase-7 等）介導Caspases蛋白的失活和降解而發揮抗凋亡的作用；Livin基因表達規律與MTT檢測的細胞活力結果一致。依托鉑苷與Livin基因表達呈量效關系，作用效果優于多柔比星及卡鉑，在臨床上可以減少腫瘤細胞的耐受性。

綜合上述，對于非小細胞肺癌，Livin基因可能通過調節腫瘤細胞的凋亡影響腫瘤的轉歸， 并可能為肺癌診斷和治療提供新的方向。

參考文獻：

[1]Gazzaniga P， Gradilone A， Giuliani L， et al. Expression and prognostic significance of LIVIN， SURVIVIN and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer[J].Ann Oncol， 2003， 14（ 1） ：85- 90.

[2]Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of anti-Livin antibody in gastrointestinal cancer patients[J] .Clin Chem， 2003，49 （ 7） ： 1206-1208.

[3]Vucic D， Stennicke H R， Pisabarro M T， et al. ML-IAP，a novelinhibitor of apotosis that a preferentially expressed in humanmelanamas [J]. Curr Biol，2000，10（21）：1359-1366..

[4]Choi J， Hwang Y K， Sung K W， et al. Expression of Livin， an antiapoptotic protein， is an independent favorable prognostic factor in child acute lymphoblastic leukemia [J].Blood，2007，109 （2）：471-477.

[5]Crnkovic-Mertens I， Hoppe-Seyler F， Butz K. Induction of tumor cells by siRNA-mediated silencing of the Livin / ML-IAP/ KIAP gene[J]. Oncogene，2003，22（51）：8330-8335.

[6]Chang H， Schimmer AD. Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatmentof malignancy [J]. Mol Cancer Ther， 2007， 6： 24-30.

編輯/申磊