精子DNA結構完整性與年齡、精子濃度、活力及形態的相關性研究

摘要：目的 探討精子DNA結構完整率與不育患者年齡、精子濃度、活力及形態的相關性。方法 回顧性分析2013年1月～2014年5月到我中心生殖醫學研究所行精子DNA結構完整性檢查的不育癥患者874例，以染色質擴散法，進行檢測，其中異常者80例。結果 DNA結構完整率正常組與異常組在年齡、精子濃度、活力及形態學有無統計學差異。結論 年齡、精子濃度、活力均跟精子DNA結構完整性有相關性，精子形態學與精子DNA結構完整性無明顯相關性。

關鍵詞：年齡；精子濃度；精子活力；精子形態；精子DNA結構完整性

在不育夫婦中，男性不育因素約占50%[1]，精子DNA損傷可能影響輔助生殖技術（ART）的結局，增加復發性自然流產的發生率及卵胞漿內單精子注射（ICSI）后代的遺傳風險等相關風險[2]。因此精子DNA完整性檢測不僅有助于探索不育的病因，而且有望成為ART治療結局的重要評估手段[3]。睪丸局部溫度增高、嚴重身心疾病、高熱、環境毒物、吸煙、嗜酒、藥物和年齡增高等原因都可能造成精子DNA的損傷，相關研究證實，空氣污染和吸煙均會導致精子DNA的碎片化程度增高[4]。本研究通過分析患者的精子濃度、活力及形態的常規檢查和精子DNA結構完整性檢測結果，并結合患者年齡，以探討不育患者年齡、精子濃度、活力及形態學與精子DNA完整性的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年1月～2014年5月在洛陽市婦女兒童醫療保健中心生殖醫學研究所就診的行精子DNA完整性檢測的874例男性不育患者作為本次研究對象。納入標準為：年齡在20～50歲（含20及50歲）的身體健康、無家族遺傳性疾病、無睪丸外傷及性功能障礙病史、無不良生活習慣（嗜酒、吸毒等），睪丸、附睪及輸精管體檢無明顯異常[5]的男性患者。

1.2方法

1.2.1精液標本收集 禁欲2～7d，手淫法取精液于一次性精液采集器內，置37℃溫箱液化，常規記錄精液的體積、pH值。

1.2.2 精液常規檢查 采用康泰CMS100醫學影像學工作站【康泰精子質量析系統】分析精子的濃度、活力。精液標本洗滌后，涂片，以（臺資）珠海貝索生物技術有限公司的Diff-Quik試劑快速染色，應用康泰CMS100醫學影像學工作站【康泰精子質量析系統】分析精子形態。

1.2.3精子DNA碎片檢測 本研究方法采用精子染色質擴散法，試劑選用深圳市博銳德生物科技有限公司生產的精子DNA碎片檢測試劑盒。精液標本主要處理過程：常規檢查后以生理鹽水調整液化的新鮮精子濃度至5～10×106/ml。取出精子濃度為5～10×106/ml的待測標本60μl加入已熔化的易熔凝膠管，充分混勻，37℃孵育待用。將包被載玻片置于2～8℃冰箱預冷5min取出，迅速加入30μl精子凝膠混合液于載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，置于2～8℃冰箱，使其凝固。5min后從冰箱中取出載玻片，小心移去覆蓋在上面的蓋玻片。將載玻片立即垂直浸入盛有反應液A的反應池，20～28℃準確反應7min，取出載玻片，濾紙吸去背面及側面殘存液體，再將載玻片垂直浸入盛有反應液B的反應池內，20～28℃準確反應25min，取出載玻片，濾紙吸去背面及側面殘存液體，再將載玻片水平浸入蒸餾水中5min，其間換水1～2次。將載玻片依次放入分別盛有70%、90%和100%乙醇的反應池中各2min。空氣中自然干燥后，載玻片以瑞氏染液15～20滴覆蓋，稍等片刻再緩慢地加入瑞氏緩沖液30～40滴，以洗耳球輕輕吹打混合染液，室溫15min后以流水輕輕沖洗染片。自然干燥或吹干后，在高倍顯微鏡下觀察500個精子，計數存在DNA碎片的精子數量。精子DNA碎片判定標準為：精子頭部僅產生較小的光暈或無光暈，單側光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。精子DNA碎片率（%）=存在DNA碎片精子數÷被觀察精子總數×100%。正常參考值：精子DNA碎片率<25%。

1.3統計學分析 數據分析采用SPSS13.0軟件完成，計量資料以x±s表示。各組組間的分析采用單因素方差分析。不育男性精子DNA完整程度與年齡、精子濃度、活力和形態的相關性分析采用Pearson相關系數并進行顯著性檢驗。以P<0.05為差異具有顯著統計學意義，P<0.01為差異具有極顯著統計學意義。其中濃度、活力及精子形態學各參數按照WHO第五版規定[6]。

2結果

2.1年齡與精子DNA完整程度的關系 年齡以35歲為界限分組，<35歲者共計551人，DNA碎片率檢測x±s為13.3±6.73；≥35歲者共計323人，DNA碎片率檢測x±s為14.9±6.83。結果顯示年齡越小，DNA碎片率越低，且具有統計學意義（P值<0.05），見表1。

2.2精子濃度與精子DNA完整程度的關系 按照濃度<15×106/ml，15～100×106/ml，>100×106/ml，分成三組檢測其DNA碎片率x±s分別為13.8±7.30，13.5±6.77，15.3±6.77，結果顯示，當精子濃度低于正常值15×106/ml時，與濃度正常時DNA碎片率無明顯統計學差異（P>0.05）；當精子濃度>100×106/ml比濃度15～100×106/ml時DNA碎片率增高，且具有統計學意義（P值<0.05），見表2～表3。

2.3精子總活力與精子DNA完整程度的關系 按精子總活力正常及不正常分組，總活力<40%者，總活率≥40%者，其DNA碎片率檢測x±s為18.1±8.32，13.1±6.44。結果顯示，當精子活力≥40% DNA時碎片率低，精子活力<40% 時DNA碎片率高，且具有明顯統計學意義（P值<0.05），見表5。

2.4精子形態學與精子DNA完整程度的關系 以正常形態率≥4%分界，<4%者與≥4%者DNA碎片率檢測x±s分別為15.2±6.35，13.7±6.88，結果顯示，精子形態學分析正常者比形態異常者DNA碎片率均值偏低，但無明顯統計學意義（P值>0.05）。見下表：

3討論

精子異常是導致男性不育的主要原因之一。目前男性精液常規檢查主要包括精液的量、pH值、精子的濃度、活力和形態[7]。但臨床中大約有15%的男性不育癥患者，精液常規檢查是正常的[8]。因此，僅僅進行精液常規檢查而進行男性生育能力以及助孕治療結局的判定還是不夠的。在過去的10 年中，人們越來越重視精子DNA完整性在男性不育診療中的作用。國外文獻報道較多，但國內相對有限，且認識不一，有學者認為精子DNA完整性與精液常規各參數無相關性[9]；有的認為精子DNA碎片化指數與精子的密度、總活動率及精子正常形態率具有負相關性[10]；還有的認為與男性年齡顯著性正相關，與直線運動精子百分率顯著性負相關[11]。為進一步研究精子DNA完整性的臨床意義，我們從2013年1月起，對在我中心生殖醫學研究所接受輔助生育技術治療的患者進行了精子DNA碎片與輔助生殖技術相關性的研究，該項目在洛陽市科學技術局立項（項目編號1302018B）。同時，對不育癥門診就診的男性患者精子DNA結構完整性與年齡、精子濃度、活力及形態等參數的相關性進行了研究，結果發現，患者年齡大于35歲時，DNA碎片率高于小于35歲者，說明精子DNA碎片率與年齡有關；精子濃度在100×106/ml以下時，精子DNA碎片率無明顯差異，當濃度大于100×106/ml時，精子DNA碎片率明顯增高，且具有統計學意義，原因尚不明確；精子總活力小于40%時，精子DNA碎片率明顯增高，說明精子DNA碎片率與活力有關；精子形態學方面，精子正常形態與精子DNA碎片率無統計學意義，無明顯相關性。本研究可以得出，精子DNA碎片率與年齡、濃度及活力均有關，而與形態無關。

參考文獻：

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編輯/申磊