液相色譜法分析龍眼及其種植土壤中的烯酰嗎啉殘留

劉景坤 武春媛 鄧曉 李怡 李勤奮

摘 ?要 ?紫外掃描確定250 nm作為烯酰嗎啉檢測波長，優化后選取甲醇+水（V ∶ V=6 ∶ 4）作為流動相不易受樣品中雜質峰的干擾且兩個組分峰具有較好的分離度。建立了烯酰嗎啉標準曲線，0.05～5 mg/kg范圍內線性關系良好（R2=0.999 7）。選擇乙腈高速勻漿提取后經過佛羅里硅藻土萃取柱凈化處理龍眼樣品，避免了雜質對目標峰的干擾，回收率77%～97%，變異系數<7%;選擇丙酮+水（V ∶ V=1 ∶ 1）作為提取劑采用2種方法（振蕩3 h、超聲振蕩各30 min）提取后土壤樣品用二氯甲烷萃取后不經凈化直接分析，結果表明對目標物分析無影響，對比2種提取方法選取超聲振蕩各30 min的方法不僅節約時間，而且回收率較高為83%～96%，變異系數<7%。

關鍵詞 ?烯酰嗎啉殘留;提取凈化;液相色譜法

中圖分類號 ?S482;O657.7 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Residue Analysis of Dimethomoph in Longan

and Soil by HPLC

LIU Jingkun1，2， WU Chunyuan1，2， DENG Xiao1，2， LI Yi1，2， LI Qinfen1，2

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Danzhou Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ?250 nm was selected as the detection wavelength by the UV spectrophotometer. 60% methanol in water was selected as the mobile phase after optimization. Two peaks with a good separation were detected without interference from the matrix. The standard curve was developed and the linear was good from 0.05 mg/kg to 5 mg/kg. Residue in longan samples were extracted by homogenate in acetonitrile and purified by florisil column， which avoided the matrix interference to the aim peaks. The recovery of the method was 77%-97% with a RSD less than 7%. At the same time， soil samples were extracted using 50% acetone in water solution via two methods， oscillation for 3 hours and ultrasonic for 30 min combined with oscillation for 30 min. Then the residues were extracted using dichloromethane from the extraction solution. Ultrasonic treatment for 30 min combined with oscillation for 30 min had a higher recovery rate 83%-96% with a RSD less than 7%.

Key words ?Dimethomoph residue; Extraction and purify; HPLC method

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.019

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烯酰嗎啉是一種內吸型治療性專用低毒殺菌劑，專一防治卵菌綱真菌性病害，化學式C21H22ClNO4，存在兩種異構體（E、Z）如圖1所示。其作用機制[1-2]是破壞病菌細胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解而使病菌死亡，對卵菌生活史的其他階段（除游動孢子外）均有作用[3-5]。該藥廣泛用于葡萄、荔枝、龍眼、番茄等作物的霜霉病、霜疫霉病、疫腐病、腐霉病等病害，與甲霜靈等苯酰胺類殺菌劑沒有交互抗性。

龍眼是人們喜愛的熱帶水果，海南四季氣候溫暖濕潤是重要的龍眼產地，但是由于溫潤的氣候條件使得龍眼種植過程中細菌、真菌等病害發生也較為常見，其中烯酰嗎啉是防治此類病害的重要農藥品種，由于該藥內吸性強[6]，根部施藥，可通過根部進入植株的各個部位;葉片噴藥，可進入葉片內部，因此，對于荔枝、龍眼等熱帶水果的質量安全就較為重要。大量或者不當使用容易造成殘留超標現象，對消費者身體健康和農田生態環境構成較大威脅。文獻有關于甘藍、番茄、葡萄中烯酰嗎啉殘留分析的報道[7-10]，但龍眼中殘留的檢測方法未見報道，因此，建立龍眼中烯酰嗎啉的分析方法對保證消費者身體健康具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品及試劑 ? 龍眼：采集自東方市月大龍眼果園（剝皮去核備用）;土壤：采集自東方市月大龍眼果園（除去石塊、植物根等其他雜物后風干處理，然后過2 mm篩室溫下保存備用）;烯酰嗎啉標準品（>96%）：購自農業部農藥檢定所;甲醇（色譜純）、佛羅里硅藻土凈化小柱（自制）。

1.1.2 ?儀器 ? 戴安高效液相色譜儀（U-3000，配PDA-100二極管陣列檢測器，Waters SYMMETRY 5 μm×4.6 mm×250 mm C18液相色譜柱）、高速勻漿機（T18，IKA）、組織粉碎機（Ashoo）、紫外-可見分光光度計（島津UV-2600）、旋蒸儀（金葉RE-3000，上海亞榮生化）、氮吹儀（美國OA-SYS）、萬分之一天平（島津）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?紫外檢測波長的確定 ? 用甲醇配制適當濃度的的烯酰嗎啉標準溶液，用紫外分光光度計進行200～380 nm波長掃描，調整烯酰嗎啉濃度使其最大吸光度值位于0.2～0.8，結果表明，烯酰嗎啉的最大吸收峰處波長為250 nm，作為液相色譜紫外檢測器的檢測波長。

1.2.2 ?流動相的確定 ? 以甲醇和超純水為流動相配比，進標準樣品，初步確定流動相配比為甲醇 ∶ 水=60 ∶ 40（V ∶ V）。

1.2.3 ?標準曲線的建立 ? 稱取10.00 mg烯酰嗎啉標準品用甲醇定容至10.00 mL，作為儲備液。用此儲備液配制系列濃度為5、2、0.5、0.1、0.05 μg/mL的標準溶液（溶劑均為甲醇）建立標準曲線。

1.2.4 ?樣品處理

（1）龍眼樣品的提取與凈化[7-11]。我國尚未制定龍眼中烯酰嗎啉的最大殘留限量，參照烯酰嗎啉在葡萄上、草莓上的最大殘留限量[12]，設定本方法3個加標濃度為0.1、0.5、1.5 mg/kg。

提取：將龍眼剝皮去核后稱取4份，每份120 g，其中1份作為空白，另外3份加入烯酰嗎啉的標準溶液，使其濃度分別為0.1、0.5、1.5 mg/kg。將4份龍眼果肉用粉碎機分別打碎（打前用甲醇充分洗凈刀頭），每份均稱取20 g，加入40 mL乙腈高速勻漿1 min后濾至加入6 g NaCl的100 mL具塞試管中，劇烈震蕩1 min，靜置30 min后吸取上清液20 mL，氮吹至近干后取出揮干待凈化，每個濃度設置5個平行樣品。

凈化：將1.0 g佛羅里硅藻土加入10 mL規格的固相萃取空柱中用真空泵加壓壓實;用10 mL正己烷+乙酸乙酯（V ∶ V=4 ∶ 1）預淋洗萃取柱，棄去淋洗液;用5 mL正己烷將上述提取液轉移至固相萃取柱中，棄去流出液;用15 mL正己烷+乙酸乙酯（V ∶ V=1 ∶ 1）洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，氮氣吹干，用甲醇復溶后定容至1 mL，待分析。

（2）土壤樣品的提取。環刀法[13]測定風干土壤的最大持水量，稱取4份×120 g風干土壤，用烯酰嗎啉的標準溶液的水溶液調節土壤含水量的最大持水量為60%，土壤中農藥濃度分別為0（空白）、0.1、0.5、1.5 mg/kg，25 ℃避光密封3 h后加入50 mL丙酮+水混合液（V ∶ V=1 ∶ 1），采取兩種方式進行提取，方法一：25 ℃避光密封搖3 h;方法二：25 ℃避光密封超聲30 min后搖動30 min。將上述土壤溶液離心后，取上清20 mL用30 mL×4次二氯甲烷提取，混合二氯甲烷層，用無水硫酸鎂干燥后旋轉蒸發至近干后揮干，用甲醇復溶后定容至1 mL，待分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?流動相比例的選擇

烯酰嗎啉分子結構存在異構體（圖1）產生雙峰[圖2中b（E體），c（Z體）]。選擇80%的甲醇（圖2-A）時，出峰時間較早，b、c距離較近，分離度相對較低，同時由于標準品純度的原因產生a峰，距離b較近干擾目標峰的積分，而且容易受到樣品分析中可能存在的極性較大的雜質干擾，因此需要將其目標峰時間延長以獲得較佳的分離度并避免干擾;當甲醇比例減小至50%時，烯酰嗎啉在14 min左右開始出峰（圖2-B），盡管b、c兩峰有較好的分離度，并且不受雜峰a的干擾，但分析時間相對較長;當甲醇比例為60%時，既能獲得較好的分離度，又能完全避開雜峰的干擾，而且分析時間相對適中（圖2-C），增加了分析的效率，節省了成本。

2.2 ?提取方法的比較

在土壤樣品的提取前，放置3 h使農藥與土壤發生吸附耦合等作用[14]，考查兩種提取方法對農藥的提取效率，結果如表1所示，搖動3 h后加標回收率比超聲后搖動稍低，同時超聲后搖動所需時間較搖動大大縮短，較大的提高了分析的效率，因此采用超聲后搖動結合的方式進行。

2.3 ?方法準確度與精密度

加標回收率來體現方法的準確度，其變異系數來衡量方法的精密度。龍眼中烯酰嗎啉殘留回收率在77%～97%之間，變異系數均<7%（表2），土壤中殘留的回收率在83%～96%，變異系數<8%，說明兩種方法穩定性均較好，回收率滿足檢測工作要求，方法檢出限0.015 mg/kg，可以用于實際樣品的檢測。

2.4 ?標準曲線的建立

將烯酰嗎啉異構體的兩個峰進行面積加和計算含量，按照優化的條件建立烯酰嗎啉的標準曲線，如圖3所示，R2達到0.999 7（n=5），在0.05～5 μg/mL范圍內線性關系良好，能夠準確定量烯酰嗎啉的殘留。

2.5 ?烯酰嗎啉樣品及標準溶液色譜圖

烯酰嗎啉標準溶液、龍眼及土壤空白樣品、龍眼及土壤加標樣品溶液色譜峰如圖4所示。烯酰嗎啉存在順反異構體，產生兩個吸收峰（圖4標準溶液），龍眼樣品經過凈化后對烯酰嗎啉的兩個樣品峰的分析均無干擾（圖4龍眼樣品加標），土壤樣品未經過凈化在11.5 min左右出現一個雜質峰，但由于烯酰嗎啉兩個峰在11.0 min左右完全流出，因此即使未經過凈化對目標物的分析也未構成干擾（圖4土壤樣品加標）。

3 ?討論與結論

植物組織中農藥殘留的提取常用乙腈，能夠在保證提取效率的同時盡量減少脂肪和色素的提取[14]。因此，龍眼中烯酰嗎啉的提取采用乙腈勻漿來進行。從化學結構可以看出，烯酰嗎啉極性相對較小，而且龍眼果肉中存在較為大量的糖分、維生素等極性較大的物質，因此采用佛羅里硅藻土柱進行凈化，將雜質組分凈化掉的同時獲得了較好的回收效果。土壤是農藥污染最主要的對象之一，而且許多農藥在施入農田后會和土壤產生較強的耦合作用，使得其提取比在植物組織中更加困難，因此在空白土壤樣品加標后放置3 h以便使土壤和農藥分子進行吸附和耦合后再進行提取，綜合文獻所報道，采用丙酮-水的混合溶液進行提取，比較了振蕩3 h和超聲波30 min加振蕩30 min兩種提取方法，結果表明后者的提取率較高，而且提取時間大大縮短，提高了工作質量和效率。

本研究參照烯酰嗎啉在葡萄、草莓中的最大殘留限量[12]，加標建立了烯酰嗎啉在龍眼果肉和栽培土壤中殘留的檢測方法，回收率均介于77%～97%，準確度較高，變異系數<7%，精密度較高，可以用于實際樣品的檢測，鑒于龍眼和荔枝果實成分的相似性，可以嘗試將本方法用于荔枝中烯酰嗎啉殘留的檢測，對保證重要的熱帶水果質量安全和環境生態保護具有重要意義。

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