超聲微波協同提取橄欖多糖及其脫蛋白工藝的研究

陳燊 曾紅亮 陳萬明 張怡

摘 ?要 ?為了研究超聲微波協同提取橄欖多糖及其脫蛋白工藝，通過考察超聲波功率、微波功率和提取時間等3個單因素對多糖得率影響的基礎上，采用正交試驗對超聲微波協同提取橄欖多糖的工藝條件進行優化，并采用酶法對橄欖粗多糖脫蛋白工藝進行研究。結果表明，超聲微波協同提取橄欖多糖的最佳工藝條件為：超聲波功率為250 W、微波功率為150 W和提取時間為15 min，在此條件下，橄欖多糖的得率為（10.6±0.3）%;橄欖多糖酶法脫蛋白的最佳工藝條件為：酶解溫度為40 ℃、酶解時間為70 min和酶添加量為70 U/g，在此條件下，橄欖多糖脫蛋白率為（77.0±2.5）%。超聲微波協同提取法是一種快速有效的提取橄欖多糖的方法。

關鍵詞 ?橄欖;多糖;超聲微波協同提取;脫蛋白

中圖分類號 ?TS201.1 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Technology of Ultrasonic/Microwave Assisted Extraction

and Deproteinization of Polysaccharides from

Canarium album（Lour.）Raeusch

CHEN Shen，ZENG Hongliang，CHEN Wanming，ZHANG Yi*

College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?Ultrasonic/microwave assisted extraction（UMAE） and deproteinization of polysaccharides from Canarium album（Lour.）Raeusch （CPS） were studied. The effects of ultrasonic power， microwave power and extraction time on the yield of CPS were investigated， respectively. Based on single factor experiments， the extraction technology of CPS extracted by UMAE was optimized by the orthogonal test. Moreover， the technology of deproteinization of crude CPS was studied using papain. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： ultrasonic power of 250 W， microwave power of 150 W and extraction time of 15 min. Under these conditions， the yield of polysaccharides could be up to （10.6±0.3）%. The optimum conditions of deproteinization were as follows： temperature of 40 ℃， time of 70 min and content of enzyme of 70 U/g. Under the above conditions，the rate of deproteinization could reach to （77.0±2.5）%. UMAE was an attractive method for extracting CPS with fast speed and high efficiency.

Key words ? Canarium album（Lour.）Raeusch;Polysaccharides;Ultrasonic/microwave assisted extraction;Deproteinization

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.021

橄欖[Canarium album（Lour.）Raeusch]又名青果、福果，是橄欖科橄欖屬植物的果實，是熱帶、亞熱帶的名優水果之一[1]。橄欖原產于中國東南地區，主要分布在福建、廣東、臺灣、四川、云南、浙江等省[2]。福建省閩侯縣被稱為“中國橄欖之鄉”，其橄欖品種多樣，栽培面積廣，產量大[3]。橄欖營養價值很高，含有人體所需多種維生素、氨基酸、多糖、黃酮等活性物質，具有清熱、利咽、祛痰、生津、健脾、解毒等功效，是醫食兼優的時令佳果[4-5]。目前，對于橄欖的研究主要針對其民間藥膳、防腐保鮮、果汁、蜜餞等方面，對其活性成分的研究還處于初步階段。

多糖是由一定數量的單糖通過一定的糖苷鍵脫水縮合成的多聚糖，是生命有機體不可缺少的組成部分，是生物體內除蛋白質和核酸以外又一類重要的生物大分子[6-7]。多糖參與了細胞的各種生命現象及生理過程的調節，具有多種生物學功能，如：抗腫瘤、提高機體免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂等[8-11]。多糖傳統水提法提取比較耗時、提取率低[12];酸堿提取法容易導致多糖結構的破壞，不利于后續構效關系的研究[13-14];超聲波輔助法和微波輔助法操作簡單，且不會引入雜質，多糖純度高，但多糖得率和產能有待提高[15]。尋找高得率且具有產業化應用潛力的提取方法至關重要。超聲微波協同提取法是近年發展起來的一種新方法，該方法充分利用超聲波的振動空化作用和微波的高能作用，具有高效、快速、安全和環保等特點，已被廣泛地應用于天然產物有效成分的提取，尤其在色素、黃酮和多糖等活性物質提取效果更好[16-17]。

因此，筆者采用超聲微波協同提取法提取橄欖多糖，在考察超聲波功率、微波功率和提取時間等3個單因素對多糖得率影響的基礎上，通過正交試驗確定超聲微波協同提取橄欖多糖的工藝條件，在此基礎上，對橄欖多糖酶法脫蛋白工藝進行了研究，旨在為研究橄欖多糖的結構、功能學特性及其綜合開發利用提供一定的理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ? 橄欖購于福建省閩侯縣;木瓜蛋白酶，北京奧博星生物技術責任有限公司;牛血清蛋白，上海勵瑞生物科技有限公司;考馬斯亮藍G-250，國藥集團化學試劑有限公司;苯酚、濃硫酸、乙醇、石油醚、葡萄糖等均為國產分析純試劑;本試驗用水均為雙蒸水。

1.1.2 ?儀器與設備 ? XH-300B微波超聲波組合催化合成萃取儀，北京祥鵠科技發展有限公司;RE-52A型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;BCD-213KC型新飛冰箱，河南新飛電器有限公司;FZ102植物粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;AL104型精密分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;丹瑞HH-6型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有雙捷實驗儀器廠;L530型臺式低速離心機，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司;Unic-UV-2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司;鹵素快速水分測定儀，深圳市冠亞電子科技有限公司;SHA-B水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;LG-1.0型真空冷凍干燥機，新陽速凍設備制造有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品前處理 ? 篩選出無任何機械損傷、病蟲害的新鮮果實，對其進行清洗、去核，經冷凍干燥后，粉碎過篩（100目），得到橄欖粉末（水分含量<3%），備用。

1.2.2 ?多糖的提取 ? 提取流程：橄欖粉末→超聲微波協同提取→離心→濾液→減壓濃縮→醇析→離心→沉淀→定容測定。

取2 g橄欖粉末加入100 mL水中，在不同超聲波功率、微波功率條件下提取不同時間，渾濁液經離心后，取濾液經減壓濃縮后靜置于4倍體積無水乙醇中沉降24 h，然后離心棄去上清液，沉淀經定容后測定。重復3次。

1.2.3 ?多糖得率的測定 ? 以葡萄糖為標樣，采用硫酸―苯酚比色法測定[18]。

標準曲線溶液配制：精確稱取干燥的葡萄糖標樣20 mg，用500 mL蒸餾水定容，分別吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，并用蒸餾水補至2.0 mL，然后加入1.0 mL 6%苯酚，再迅速加入5.0 mL濃硫酸，顯色后在冷水中冷卻15 min，在波長490 nm處測定吸光度OD值，以蒸餾水代替葡萄糖作空白對照。

樣品測定：吸取1.0 mL樣品液按照上述步驟操作，在波長490 nm處測定吸光度OD值，以標準曲線計算多糖得率。

多糖得率計算公式：

多糖得率/%=■×100

1.2.4 ?蛋白質含量測定 ? 標準曲線溶液配制：精確移取牛血清白蛋白標準溶液（濃度為0.1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置試管中，加入去離子水，使每支試管中溶液體積為1 mL，搖勻。然后每管中分別加入5.0 mL染色液，搖勻，室溫靜置3 min，于波長595 nm處測定吸光度OD值，以空白溶液作對照。

樣品測定：吸取1.0 mL樣品液按照上述步驟操作，在波長595 nm處測定OD值，以標準曲線計算蛋白質濃度。

1.2.5 ?超聲微波協同提取橄欖多糖 ? 單因素試驗：取2 g金柑粉末，加入100 mL水，以橄欖多糖得率為指標，研究超聲波功率、微波功率和提取時間對多糖得率的影響。

正交試驗：根據單因素試驗結果，選取超聲波功率（X1）、微波功率（X2）、提取時間（X3）等3因素，各3個水平，以多糖得率為指標，按L9（34）正交表試驗，得出超聲微波協同提取橄欖多糖的最佳工藝參數。

1.2.6 ?橄欖多糖酶法脫蛋白 ? 單因素試驗：精確稱取2 g橄欖多糖，配制成2 mg/mL，pH6.5多糖溶液，以脫蛋白率為指標，研究木瓜蛋白酶酶解時不同的酶解溫度、酶解時間、酶添加量對脫蛋白率的影響。

正交試驗：根據單因素試驗結果，選取酶解溫度（X1）、酶解時間（X2）、酶添加量（X3）3因素，各3個水平，以脫蛋白率為指標， 按L9（34）正交表做試驗，得出橄欖多糖酶法脫蛋白的最佳工藝參數。

脫蛋白率計算公式：

脫蛋白率/%=■×100

公式中c1：脫蛋白前的蛋白質濃度（μg/mL）;c2：脫蛋白后的蛋白質濃度（μg/mL）。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線

多糖標準曲線：y=7.216 1x+0.041 5（r2=0.999 7）。表明0～0.08 mg/mL葡萄糖含量與y呈良好的線性關系。x—表示葡萄糖含量（mg/mL）;y—表示在波長490 nm處吸光度OD值。

蛋白質標準曲線：y=0.006 4x+0.003（r2=0.999 7）。表明在0～100 μg/mL牛血清白蛋白溶液濃度與吸光度OD值呈良好的線性關系。x—表示牛血清白蛋白溶液濃度（μg/mL）;y—表示吸光度OD值。

2.2 ?超聲微波協同提取橄欖多糖工藝研究

2.2.1 ?超聲波功率對橄欖多糖得率的影響 ? 當微波功率為100 W，提取時間為10 min條件下，試驗結果見圖1。超聲波功率在100～250 W時，多糖得率隨超聲波功率的增加而增加，但當超聲波功率高于250 W時，多糖得率隨著超聲波功率增加而減少，這可能是由于過高的超聲波功率會導致多糖降解[19]。因此，選擇250 W為實驗最佳的超聲波功率。

2.2.2 ?微波功率對橄欖多糖得率的影響 ? 當超聲波功率為250 W，提取時間為10 min條件下，試驗結果見圖2。微波功率在25～150 W時，多糖得率隨微波功率增加而增加，但當微波功率高于150 W時，多糖得率隨著微波功率增加而減少，這可能是由于過高的微波功率導致多糖降解[20]。因此，選擇150 W為實驗最佳的微波功率。

2.2.3 ?提取時間對橄欖多糖得率的影響 ? 當超聲波功率為250 W，微波功率為150 W條件下，試驗結果見圖3。提取時間在5～15 min時，多糖得率隨提取時間增加而增加，但當提取時間超過15 min時，多糖得率隨著提取時間增加而減少，這可能是由于過長的超聲波和微波作用時間會使多糖分子鏈發生斷裂，從而降低多糖的得率。因此，選擇15 min為實驗最佳的提取時間。

2.2.4 ?提取工藝的確定 ? 在單因素試驗基礎上，用正交試驗對影響橄欖多糖得率的因數進行條件優化（表1）。

由表2可知，各因素對橄欖多糖得率的影響大小依次為：超聲波功率>微波功率>提取時間;超聲微波協同提取橄欖多糖的最佳工藝條件為：A2、B2和C2，即超聲波功率250 W，微波功率150 W，提取15 min。

由表3可知，超聲波功率和微波功率對橄欖多糖得率影響達極顯著水平，提取時間對橄欖多糖得率影響達顯著水平。在最佳工藝條件下，橄欖多糖得率為（10.6±0.3）%。

2.3 ?橄欖多糖酶法脫蛋白工藝研究

2.3.1 ?酶解溫度對脫蛋白率的影響 ? 當酶解時間60 min，酶添加量50 U/g時，結果見圖4。酶解溫度在10～40 ℃時，脫蛋白率隨酶解溫度增加而增加，但當酶解溫度超過40 ℃時，脫蛋白率隨著酶解溫度增加而減少，這可能是因為當溫度超過酶的最適反應溫度后，酶蛋白質變性，使得酶活力減弱，直至完全喪失活力，反應速度隨著溫度升高迅速下降[21]。因此，選擇40 ℃為實驗最佳的酶解溫度。

2.3.2 ?酶解時間對脫蛋白率的影響 ? 當酶解溫度為40 ℃，酶添加量為50 U/g時，結果見圖5。當酶解時間在40～70 min時，脫蛋白率隨酶解時間增加而增加，但當酶解時間超過70 min時，脫蛋白率幾乎不變，這是由于酶解反應時間和酶解進行程度有密切的關系，反應時間太短，酶解不充分;而當酶濃度達到一定時，酶促反應的時間延長并不能使脫蛋白率顯著增加[22]。因此，選擇70 min為實驗最佳的酶解時間。

2.3.3 ?酶添加量對脫蛋白率的影響 ? 當酶解溫度為40 ℃，酶解時間為70 min時，結果見圖6。酶添加量在30～60 U/g時，脫蛋白率隨酶添加量增加而增加，但當酶添加量超過60 U/g時，脫蛋白率幾乎不變。因此，選擇60 U/g為實驗最佳的酶添加量。

2.3.4 ?脫蛋白工藝的確定 ? 在單因素試驗基礎上，用正交試驗對影響橄欖多糖脫蛋白率的因數進行條件優化（表4）。

由表5可知，各因素對橄欖多糖脫蛋白率的影響大小依次為：酶解溫度>酶解時間>酶添加量;橄欖多糖酶法脫蛋白的最佳工藝條件為：A′2、B′2和C′3，即酶解溫度40 ℃、酶解70 min，酶添加量70 U/g。

由表6可知，酶解溫度對橄欖多糖脫蛋白率影響達極顯著水平，酶解時間和酶添加量對橄欖多糖脫蛋白率影響達顯著水平。在最佳工藝條件下，橄欖多糖脫蛋白率為（77.0±2.5）%。

3 ?討論與結論

超聲波-微波協同法將振動超聲與開放式微波兩種作用方式相結合。充分利用超聲振動的空化作用以及微波的高能作用，使樣品各點內受到的作用一致。降低目標物與樣品基體的結合力，加速目標物從固相進入溶劑的過程。而單獨微波輔助提取法主要是利用微波穿透強、加熱快的特點，使植物細胞內迅速產生大量的熱量，增強細胞內的壓力，沖破細胞，使活性成分溶出。李永裕等[23]橄欖多糖微波輔助提取工藝研究中，采用微波前處理-熱水浸提，在最優條件下得到的橄欖多糖得率為9.38%，相比本研究結果有所提高。

超聲微波協同提取法充分利用了超聲波的振動空化作用和微波的高能作用，提取效率高，多糖純度高。超聲微波協同提取法是一種快速有效的提取橄欖多糖方法，但各種提取方法對橄欖多糖結構和活性的影響有待進一步研究。

傳統脫蛋白方法有鹽析法、TCA法、Sevag法，都存在著有機溶劑量大，耗時長，水相與有機相的分離，容易造成損失等缺點。現嘗試以酶法脫除多糖中的蛋白質，以期為將來的生產提供理論依據。酶法能有效除去橄欖粗多糖中蛋白質雜質，本研究使用木瓜蛋白酶脫除橄欖粗多糖的蛋白質，相較于之前賈媛穎[24]用SEVAGE法脫除蛋白方法，不引入有機試劑，因而能夠較好應用于工業生產中，為進一步研究橄欖多糖理化性質、分離純化、結構表征、構效關系及其綜合開發利用提供基礎。

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