MonoTrap法捕集白木香愈傷組織揮發性成分及其GC—MS分析

張珂 陳華姑 龔勝 孫海燕 王健

海南大學園藝園林學院熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室 ?海南?？?570228

摘 ?要 ?采用新型材料MonoTrap作為頂空固相萃取的吸附劑，捕集茉莉酸甲酯（MeJA）處理后的白木香愈傷組織揮發性成分，并應用GC-MS分析測定其化學成分及相對含量。結果表明，從MeJA不同處理下的白木香愈傷組織中共鑒定出56種揮發物成分，主要成分為脂肪烴類、芳香族類和倍半萜類等成分;通過正交實驗法確定最佳捕集方法為：不破碎愈傷組織材料，于30 ℃條件下、采用MonoTrap捕集6 h。MonoTrap法結合氣質聯用具有高靈敏度、強針對性和可操作性強的優點，可以為白木香的開發利用提供理論依據。

關鍵詞 ?白木香;愈傷組織;揮發性成分;MonoTrap;氣相色譜-質譜

中圖分類號 ?R284 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

GC-MS Analysis on the Volatile Constituents Adsorbed with Mono Trap from Callus of Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg.

ZHANG Ke， CHEN Huagu， GONG Sheng， SUN Haiyan， WANG Jian*

College of Horticulture & Landscape Architecture， Hainan University，/Key Laboratory of Protection and Development

Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?A novel material MonoTrap was used as the adsorbent of headspace solid phase extraction to absorb the volatile constituents from the MeJA-treated callus of Aquilaria sinensis. Then， the chemical constituents and relative contents of the volatile components were analyzed by GC-MS. The results showed that there were 56 compounds found in the MeJA-treated callus of A. sinensis， in which， the main constituents were aliphatic hydrocarbons， sesquiterpenoids and aromatics. The best absorbing method according to the results of orthogonal experimental was： non-broken callus materials， 30 ℃， absorbing for 6 h. MonoTrap coupled with GC-MS had advantages of high sensitivity， strong pertinence and operability. The study can provide a simpler and more flexible method for the volatile constituents analysis of A. sinensis（Lour.）Gilg.

Key words ?Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg;Callus;Volatile components;MonoTrap;Gas Chromatography-Mass Spectrometry

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.024

白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg.]又名土沉香、牙香樹、女兒香、香材、芫香，為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）植物，是一種熱帶、亞熱帶常綠喬木，產于廣東、海南、廣西、福建等省區[1]。其含樹脂的木材稱為沉香，為《中國藥典》收載的品種;味辛、苦、溫，歸脾、胃、腎經，具有降氣、溫中、暖腎助陽的功能;主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥[2]。長期以來由于森林資源、生態環境遭受自然災害和人為破壞，白木香野生資源破壞極其嚴重，瀕臨滅絕，現已被列為國家三級珍稀瀕危保護植物及國家二級重點保護野生植物[3-4]，并被載入《中國植物紅皮書》[5]，為中國特有的珍貴藥用植物。

沉香藥效的主要有效成分是沉香揮發油，以倍半萜類和芳香族化合物為主，此外還含有脂肪酸及脂肪烷類等物質[6]。近年來，有學者提出“白木香防御反應結香假說”和“激發子誘導結香假說”[7-8]，認為茉莉酸甲酯（MeJA）作為“激發子”可誘導白木香產生防御反應，生成具有抑菌活性的防御類物質，參與調節次生代謝產物途徑。日本學者Ito等[9]，Okudera[10]在無菌條件下，將MeJA加入白木香懸浮細胞中，誘導產生了α-愈創木烯（α-guaiene）、α-葎草烯（α-humulene）和δ-愈創木烯（δ-guaiene）。Xu等[11]采用固相微萃取技術（SPME）結合GC-MS檢測分析白木香愈傷組織揮發性成分，在未經處理的健康的白木香愈傷組織中只發現有α-愈創木烯和δ-愈創木烯2種倍半萜;在MeJA處理后的白木香愈傷組織中發現有4種倍半萜，這些物質可能是白木香防御類物質和沉香類前體物質。

目前，白木香少量組織的揮發性成分的鑒定主要用SPME技術[9-11]。SPME技術是一種新型的無溶劑樣品預處理技術，但存在價格昂貴、萃取頭易碎且需要進行高溫解吸處理、聚合物圖層性質不穩定、易產生樣品攜帶等缺陷[12]。固相萃取整體捕集劑MonoTrap是用于捕集和萃取的新生代介質，是集硅膠、活性炭、ODS特性為一體的高交聯性新吸附劑，優點在于其硅膠骨骼里混合了活性炭，對極性物質、低沸點物質、芳烴的吸附有很大作用;可吸附包括在任何基質中的揮發性、不揮發性、極性（中性或酸性）、非極性、液態及氣態物質;既可用少量有機溶劑萃取，也可用熱脫附共色譜分析，十分適合少量和微量材料的揮發性成分捕集，不需要對萃取成分進行高溫解吸處理，且方便攜帶，比常用的SPME使用方法更靈活，靈敏度更高[13]，在香味成分、食品、環境的濃縮分析、篩選分析中，作為捕集工具的使用越來越多[14]。

筆者采用MonoTrap法捕集經過MeJA處理的白木香愈傷組織揮發性成分，通過氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對其化學成分進行分析研究，探索該檢測方法的有效捕集條件，驗證該方法檢測白木香愈傷組織揮發性成分的有效性，為進一步開發利用白木香提供科學依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試白木香采自海南大學農科實驗基地;愈傷組織由本實驗室用三年生白木香幼嫩莖段誘導培養生成。

HP6890/5973型GC/MS氣相色譜質譜聯用儀（美國惠普公司）;ABJ220-4M電子分析天平（德KERN）;KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;QYN100-2氮吹儀（上海喬躍電子有限公司）;固相萃取整體捕集劑DCC18 MonoTrap（上海島津GL生物技術有限公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?MonoTrap法捕集白木香愈傷組織揮發性成分 ? 將白木香愈傷組織轉接入含100 μmol/L MeJA的培養基中培養7 d。在單因素試驗基礎上，設置吸附時間（A）、溫度（B）、材料處理（C）3個因素作為變量，采用L9（34）正交表優化試驗條件。各因素設3個水平：吸附時間設1、6、12 h;溫度設30、60、40 ℃;材料處理設機械破碎，不破碎和室溫下風干0.5 h。各處理均準確稱取0.6 g經MeJA處理后的愈傷組織，按試驗設計進行材料處理，分別放入20 mL樣品瓶里，將1片MonoTrap DCC18懸于樣品瓶中的頂空固定架上，按試驗設計溫度與時間，頂空捕集白木香愈傷組織揮發性成分。揮發性成分采集完成后，將MonoTrap取出置于塑料襯管中，加二氯甲烷1mL超聲萃取5 min，取上清液于1.5 mL離心管中，氮吹濃縮至100 μL，作為GC-MS檢查樣品。

1.2.2 ?GC-MS分析條件 ? 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS 5%Pheny Methy Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫60 ℃（保留2 min），以6 ℃/min升至300 ℃，保持4 min，汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He（99.999%），柱前壓0.526 bar，載氣流量1.0 mL/min;進樣量1 μL;分流比20 ∶ 1。

質譜條件：離子源為EI源;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發射電流34.6 μA;倍增電壓837 V;接口溫度280 ℃;質量范圍50～500 amu。

1.3 ? 數據統計與分析

1.3.1 ?正交試驗數據統計 ? 正交試驗結果以有無捕集到倍半萜類物質為考核指標進行評分，捕集到0種的處理記1分，捕集到1種的處理記3分，捕集到2種的處理記6分，捕集到3種的處理記9分，捕集到4種的處理記10分。根據試驗結果進行正交試驗的直觀分析與方差分析。

1.3.2 ?GC-MS分析與鑒定 ? 用毛細管色譜法對白木香愈傷組織揮發性成分進行分離及含量分析;用色譜峰面積歸一化法測得各組分的相對含量;用氣相色譜-質譜總離子流色譜檢測得GC-MS總離子流圖;所得色譜和質譜信息利用計算機NIST11.L質譜數據庫自動檢索和人工解析，確定化合物名稱及相對含量。

2 ?結果與分析

2.1 ?MonoTrap法萃取最佳條件的確定

最佳萃取條件的正交試驗結果見表1。通過對表1相關數據進行直觀分析可見：A2>A3>A1，B1>B2>B3，C2>C3>C1，A2，B1，C2的水平較好，最佳萃取組合為A2B1C2;3因素對愈傷組織揮發性成分的影響順序為C>B>A。根據以上結果，確定MonoTrap法頂空捕集白木香愈傷組織揮發性成分的條件為：不破碎愈傷組織材料，于30 ℃捕集6 h。

2.2 ?氣相色譜-質譜的分析與鑒定

經過正交試驗處理，分別獲得9個捕集條件下白木香愈傷組織揮發性成分總離子流圖（圖1）。

對9個處理獲得的揮發性物質進行分析合并，將其名稱及相對含量按照保留時間排列順序如表2。實驗共鑒定出Monotrap捕集不同處理下白木香愈傷組織中的56個化合物，占揮發性物質總量的48.83%。由表2可知，白木香愈傷組織揮發性成分中脂肪烴類含量最高，平均含量達38.57%，其次為芳香族類，平均含量達7.90%，9個處理共檢出4種倍半萜成分。十八烷、二丁基羥基甲苯、四甲基十六烷、二十一烷、二十四烷和3-（3，5-二叔丁基-4-羥基苯基）丙酸甲酯等化合物在9種處理中均能檢出，相對百分含量也大致相同，說明這些成分在不同捕集條件下揮發比較穩定。而個別揮發性成分在不同處理中差異相當大，如鄰苯二甲酸二異辛酯僅在處理1和6中檢出，且含量差異很大，說明該成分對不同的捕集條件比較敏感。

對檢測到的β-欖香烯、α-愈創木烯、α-葎草烯、δ-愈創木烯4種倍半萜類物質的分析結果如下：處理1、6和8為破碎愈傷組織材料，均未能檢測出，說明材料破碎會極大影響倍半萜成分的揮發;處理3和9為40 ℃條件下萃取，均有檢測出β-欖香烯，處理2和5為60 ℃條件下萃取，均有檢測出α-愈創木烯和δ-愈創木烯，說明不同溫度處理可影響倍半萜類化合物種類的萃取;處理7檢測出β-欖香烯、α-愈創木烯、δ-愈創木烯3種倍半萜成分;處理4檢測出β-欖香烯、α-愈創木烯、α-葎草烯、δ-愈創木烯4種倍半萜成分，且僅有處理4檢出了α-葎草烯?？傮w來看，這4類倍半萜成分對捕集條件比較敏感。

3 ?討論與結論

從本研究結果看，所有愈傷組織破碎條件下的處理都沒有檢測出倍半萜類特征性成分，可見愈傷組織破碎可嚴重影響倍半萜類物質的檢出，可能是因為萜烯類化合物極不穩定，在細胞破碎時發生了一系列化學反應[15]。本試驗結果也表明萃取溫度和吸附時間均對白木香愈傷組織揮發性成分有一定影響。從吸附時間結果來看，吸附6 h的檢出效果好于吸附1 h， 說明隨著處理時間增加，愈傷組織揮發的倍半萜類種類增加，符合揮發物隨時間增加而增多的一般規律，但到了12 h又有所下降（表1），原因可能是長時間處理下，Monotrap吸附材料對萜烯類的吸附能力加強，導致后期二氯甲烷對這些成份洗脫困難而不易檢測出。從吸附溫度來看，高溫條件下檢出效果明顯比30 ℃時差（表1），說明高溫會減少萜烯類成份的揮發與檢測，可能是愈傷組織細胞在高溫脅迫下，隨脅迫時間增加，細胞活力逐漸降低，膜質過氧化程度逐漸增加[16]，導致倍半萜類物質的損失?？傮w來看，白木香愈傷組織揮發性成份中倍半萜類成分含量很低且穩定性較差（表2），因此對材料前期處理比較敏感，破碎、高溫、吸附時間過長均會減少其檢出效果，所以檢測時材料應保持自然狀態。白木香是一種典型的傷害誘導型藥用植物，只有在傷害等脅迫條件或外界刺激誘導下才能夠在其木質部內產生倍半萜等沉香類物質[17]。戚樹源等[18]分析檢測在健康白木香木材組織中沒有沉香倍半萜類成分，其主要成分為棕櫚酸、油酸和亞油酸等脂肪酸與本研究檢測到的揮發性成分有較大的差異，證明誘導作用是產生這些防御類物質和沉香倍半萜類前體物質的重要條件。Ito等[9-10，17]在經過MeJA處理的白木香懸浮細胞或莖干中，檢測到了α-愈創木烯（α-guaiene）、α-葎草烯（α-humulene）和δ-愈創木烯（δ-guaiene）等成分，與本研究結果類似。但這些研究中一般只檢測到3種倍半萜類物質，而本研究則檢測出4種倍半萜類物質，在白木香愈傷組織檢測出β-欖香烯，說明本方法具有更高的靈敏性。β-欖香烯具有氣特異、微香的特性，同時β-欖香烯還具有抑制轉移、抗多藥耐藥、抗腫瘤免疫、化療增效、放療增敏等作用[19]。

本研究結果也可以看出，不同的處理檢測出的成分種類及含量有較大的差異，說明該方法對捕集條件靈敏地響應。由于白木香不同品種、不同部位作為外植體，不同培養條件，不同誘導方式等因素，會導致愈傷組織中倍半萜和芳香族物質種類和含量存在較大差異，因此不同條件下白木香愈傷組織中倍半萜成分檢測的捕集條件還需要進一步有針對性的優化，才能獲得更為理想的結果。

參考文獻

[1] 中國科學院“中國植物志”編輯委員會. 中國植物志[第52（1）卷][M]. 北京： 科學出版社， 1999： 290.

[2] 中華人民共和國藥典編委會. 中華人民共和國藥典（一部）[S]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2010： 128-129.

[3] 國家環境保護局， 中國科學院植物研究所.中國珍稀瀕危保護植物名錄（第一冊）[M]. 上海： 上?？萍冀逃霭嫔?， 1987： 94.

[4] 國家林業部， 國家農業部.國家重點保護野生植物名錄（第一批）[S]. 1999年8月4日國務院批準[J]. 環境教育， 2008（7）： 84.

[5] 中國科學院植物研究所. 中國植物紅皮書-稀有瀕危植物[M]. 北京： 科學出版社， 1992： 670-671.

[6] 郭曉玲，田佳佳，高曉霞，等. 不同產區沉香藥材揮發油成分GC-MS分析[J]. 中藥材， 2009， 32（9）： 1 354-1 358.

[7] 張 ?爭， 楊 ?云， 魏建和，等. 白木香結香機制研究進展及其防御反應誘導結香假說[J]. 中草藥， 2010， 41（1）： 156-159.

[8] 朱智強. 白木香的結香機理及造香技術[J]. 熱帶林業， 2013， 41（3）： 31-33.

[9] Ito M， Okimoto K， Yagura T， et al. Induction of sesquiterpenoid production by ?methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell suspension culture[J]. Journal of Essential Oil Research， 2005， 17： 175-180.

[10] Okudera Y， Ito M. Production of agarwood fragrant constituents in Aquilaria calli and cell suspension cultures[J]. Plant Biotechnology， 2009， 26： 307-315.

[11] Xu Y H， Zhang Z， Wang M X， et al. Identification of genes related to agarwood formation： transcriptome analysis of healthy and wounded tissues of Aquilaria sinensis[J]. BMC Genomics，2013， 14： 227.

[12] 汪瑾彥， 陳大舟， 湯 ?樺，等. 水體沉積物和土壤中多環芳烴的分析方法研究[J]. 現代儀器， 2010， 16（2）： 11-15.

[13] 佐藤睦， 外丸騰彥， 武田まなゐ，等. 運用新生代型整體構造高交聯吸附劑“MonoTrap”進行樣品捕集、 加熱脫附、 有機溶劑萃取的方法研討[C]. 第十七屆全國色譜學術報告會論文集，2009： 868-868.

[14] 王 ?晨. 不同桂花品種的香氣成分分析及紅外光譜鑒定模型初步建立[D]. 南京： 南京林業大學， 2012.

[15] 張赟彬， 繆存鉛，崔儉杰. 吹掃/捕集-熱脫附氣質聯用法對荷葉揮發油成分的對比分析[J]. ?化學學報， 2009， 67（20）： 2 368-2 374.

[16] 鞏慧玲. 植物愈傷組織對高溫脅迫的生理響應及G6PDH對高溫適應的調節機理研究[D]. 蘭州： 蘭州大學， 2011.

[17] 張 ?爭， 楊 ?云， 魏建和，等. 白木香莖中內源茉莉酸類和倍半萜類物質對機械傷害的響應[J]. 園藝學報， 2013， 40（1）：163-168.

[18] 戚樹源， 陸碧瑤， 朱亮峰，等. 白木香中白木香醛形成的研究[J]. 植物生理學通訊， 1992， 28（5）： 336-339.

[19] 王宏虹， 劉華鋼， 劉麗敏. β-欖香烯抗腫瘤作用機制研究概況[J]. 藥物評價研究， 2009， 32（2）： 140-143.