超聲強化法提取藍莓多糖的工藝研究

李敬 趙慶生 周偉杰 趙士豪

摘 ?要 ?以藍莓為材料，利用超聲強化法提取藍莓多糖。在單因素試驗基礎上，利用響應面法考察超聲功率、提取時間、液固比對藍莓多糖提取率的影響。得到最優(yōu)提取工藝條件為： 超聲功率600 W，超聲時間 87 min，液固比49 mg/g，在此條件下，藍莓多糖提取率理論值為4.93%，驗證實測值為4.91%，與預測值接近，說明該試驗方案可行。

關鍵詞 ?藍莓;多糖;超聲強化;響應面分析

中圖分類號 ?S663.9 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharides from Blueberries by Response Surface Analysis

LI Jing1*， ZHAO Qingsheng2， ZHOU Weijie3，ZHAO Shihao1

1 ?College of Biology Science and Engineering， Hebei University of Economics and Business， Shijiazhuang， Hebei 050061， China

2 ?National Key Laboratory of Biochemical Engineering， Institute of Process Engineering，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China

3 ?Huangdao Food and Drug Administration， Qingdao， Shandong 266555， China

Abstract ?In the present study， the conditions for ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from blueberries were optimized by response surface analysis. On the basis of single-factor experiments， the relationship between main extraction conditions including ultrasonic power， water to solid ratio and extraction time were modeled using a 3-factor， 3-level Box-Behnken experimental design. The established model was analyzed by response surface methodology to obtain the optimum extraction conditions. The optimum conditions of the ultrasonic wave extraction of blueberries polysaccharides were as follows： extraction ultrasonic power of 600 W， water to solid ratio 49 mg/g and extraction time of 87 min. The predictive maximum yield of blueberries polysaccharides was 4.93%. The average validation value was 4.91%. The optimized technology was stable and viable.

Key words Blueberries;Polysaccharides;Nltrasonic extraction;Response surface methodology

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.022

藍莓（Vaccinium uliginosum），又稱越橘果、越橘、藍漿果，為杜鵑花科越橘屬（Vacctnium）落葉或常綠灌木，是多年生的漿果類果樹。藍莓果肉細膩，風味獨特，酸甜適口，營養(yǎng)價值遠遠高于其他水果，堪稱“世界漿果之王”。因其具有較高的保健價值而風靡世界，是聯(lián)合國糧農組織（FAO）推薦的五大健康水果之一。藍莓含有豐富的營養(yǎng)物質[1]，如蛋白質、脂肪、碳水化合物，VA、VE、超氧化物歧化酶（SOD）等。此外，藍莓的微量元素含量也很高，鮮果中含鈣、磷、鎂、鋅、鐵、鍺、銅等[2]。除含有常見的營養(yǎng)成分外，藍莓果實中還富含熊果苷、花青苷[3-4]、多酚[5]、胡蘿卜素、類黃酮、多糖[6]等。Mattila等[7]發(fā)現(xiàn)藍莓果皮每100 g含酚酸為85 mg。Bere[8]發(fā)現(xiàn)藍莓含有人體必須脂肪酸亞麻油酸，含量約0.25 g/100 g，脂肪則占0.75 g/100 g。不僅具有良好的營養(yǎng)保健作用，還具有較強的抗癌作用[9]、保護心腦血管[10]以及輔助治療糖尿病[11]等功效。

目前， 藍莓多糖研究國內鮮有報道，本研究采用超聲提取法分離藍莓中的多糖成分，為藍莓多糖的生產和應用提供一定的理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗材料：藍莓（藍豐，采收自北京懷柔）。

儀器：電子分析天平FA2004（上海天平儀器廠），KQ-250DB 型超聲波儀（昆明市超聲儀器有限公司），8002型恒溫水浴控制器（余姚明偉儀表廠），CT15RT臺式高速冷凍離心機（上海天美生化儀器設備工程有限公司），RE-52型旋轉蒸發(fā)儀（上海博通經貿有限公司產品），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），F(xiàn)D-1冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司），2802UV/VIS 分光光度計（尤尼科上海儀器有限公司）。

試劑：乙醇、濃硫酸、苯酚、標準葡萄糖、溴化鉀等，所用試劑均為國藥集團化學試劑有限公司分析純產品。

1.2 ?方法

1.2.1 ?多糖提取工藝流程 ? 精確稱取藍莓粉末→80%乙醇回流→離心→殘渣干燥→超聲提取→離心→收集上清液→濃縮→加入4倍體積95%乙醇→低溫靜置24 h→離心→沉淀→冷凍干燥→多糖

1.2.2 ?多糖含量測定 ? 采用苯酚-硫酸法進行多糖含量的測定，準確稱取干燥恒重的葡萄糖40 mg于500 mL容量瓶中，加水定容，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以水補至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜止10 min，搖勻，室溫放置30 min后于490 nm測光密度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白，重復3次，求平均值，以橫坐標為多糖濃度，縱坐標為光密度值（OD），得標準曲線。

藍莓多糖含量的測定：準確稱取多糖粉末，加水溶解，按照上述步驟測定并計算純多糖含量，每個樣品做3次。藍莓多糖提取率按照以下公式計算：

多糖提取率/%=■×100

1.2.3 ?單因素試驗 ? 分別以超聲功率、提取時間、液固比以及提取次數(shù)為單因素進行試驗，考察各單因素對浸提液中水溶性多糖得率的影響。重復3次，求平均值。

超聲功率對多糖提取率的影響：固定提取時間、液固比，超聲功率分別設定為200、400、600、800、1 000 W。

超聲時間對藍莓多糖提取率的影響：固定液固比、超聲功率， 超聲時間分別設定為20、40、60、80、100、120、140 min。

液固比對藍莓多糖提取率的影響：固定超聲功率、超聲時間，液固比分別設定為30、40、50、60、70 mL/g。

提取次數(shù)對藍莓多糖提取率的影響：固定超聲功率、超聲時間、液固比，提取次數(shù)設定為1、2、3、4次。

1.2.4 ?Box-Behnken的中心組合試驗設計 ? 基于單因素的實驗結果，利用Design-Expert軟件進行響應面試驗設計。

1.2.5 ?熱水提取 ? 為了對比超聲提取與熱水提取的差別，取適量藍莓，經前處理，在80 ℃條件下，提取2 h，其他步驟同1.2.2，重復3次，求平均值。

1.2.6 ?多糖的紅外分析 ? ?取適量經冷凍干燥的藍莓多糖與溴化鉀充分研磨，壓片，用紅外光譜儀于4 000～400 cm- 1波長范圍內掃描。

2 ?結果與分析

2.1 ?單因素試驗結果

2.1.1 ?超聲功率對藍莓多糖提取率的影響 ? 由圖1可知，隨著超聲功率的增加，多糖提取率先升高后降低，多糖提取率降低的原因可能是超聲功率過高導致多糖降解所致。600 W時，提取率最高。因此，選取600 W作為下一步優(yōu)化的因素。

2.1.2 ?超聲時間對藍莓多糖提取率的影響 ? 由圖2可知，隨提取時間的延長，提取效率先升高后降低。原因可能在于時間過短，多糖提取不充分;待多糖充分提取之后，繼續(xù)增加提取時間，多糖在超聲作用下發(fā)生降解，因此多糖的得率不但沒有增加，反而降低。

2.1.3 ?液固比對藍莓多糖提取率的影響 ? 液固比對多糖提取率具有重要影響，溶劑量大有利于多糖的擴散，促使多糖快速進入溶劑體系。由圖3可以看出，液固比對多糖提取率稍有影響，但不明顯，液固比在50 ∶ 1時，多糖提取率達到最高值。

2.1.4 ?提取次數(shù)對藍莓多糖提取率的影響 ? 由圖4可知，提取次數(shù)對多糖提取率影響不大。因此，從經濟方面考慮，藍莓多糖提取1次即可。

2.2 ?響應面設計及結果分析

以單因素試驗的結果為基礎，根據Box-Behnken設計原則，選取超聲功率、提取時間、液固比3個對藍莓多糖提取率影響顯著的因素，采用三因素三水平的響應面分析方法對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。試驗因素與水平設計見表1。

響應面方案的實驗結果見表2。對表2 數(shù)據采用Design Expert 8.0 軟件進行處理和分析，獲得藍莓多糖提取率（Y）對超聲功率、提取時間、液固比的二次多元回歸方程：

Y=4.77+0.13A+0.20B+0.21C-0.047AB-0.14AC+0.058BC-0.60A2-0.48B2-0.078C2

對二次回歸方程進行方差分析見表3，模型p<0.01，此時回歸方差模型極其顯著，表明該試驗方法可靠。方程失擬項不顯著，表明該回歸模型與實測值能較好的擬合。回歸系數(shù)R2=0.955 6>0.9，表明該模型相關度好。回歸方程各項的方差分析表明，對多糖提取率影響大小順序為C>B>A。

各因素之間的相互關系如圖5～7所示。由圖5可以看出，無論固定提取時間還是超聲功率，隨著另一變量的增加，多糖提取率都是先升高后降低，說明超聲時間和超聲功率對多糖提取率影響較為明顯。由圖6～7可知，固定液固比因素，隨著超聲功率或提取時間的增加，多糖的提取率先升高后降低，而固定超聲功率或提取時間，增加液固比，多糖的提取率都是增加的，說明溶液體系的增大，多糖更容易溶解在液體中，同時受到超聲的破壞也不再顯著。

2.3 ?模型驗證

根據結果，響應面給出的多糖得率最優(yōu)方案為： 超聲功率598.82 W，超聲時間 87.16 min，液固比49.45 mg/mL。為了操作簡便，方案修訂為超聲功率600 W，超聲時間 87 min，液固比49 mg/g，在此條件下，藍莓多糖提取率理論值為4.93%，驗證實測值為4.91%，與預測值接近，驗證了模型的正確性。

2.4 ?紅外分析

由圖8可知，超聲提取與熱水提取制備的多糖，在紅外圖譜結構上差異不大;3 334 cm-1的吸收峰為O-H的伸縮振動，1 103cm-1 ?吸收峰是仲碳-OH 的O-H 變角振動引起;3 334cm-1、1 637cm-1、1 443cm-1、1 103cm-1 吸收峰均出現(xiàn)糖類典型特征的吸收峰，1 744 cm-1附近出現(xiàn)羰基的伸縮振動峰，1 332 cm-1 的吸收峰為C=O對稱伸縮振動，表明含有酸性糖成分。

3 ?討論與結論

多糖廣泛存在于植物根、莖、葉及果實中，具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒及輔助降血糖等多種生物活性。因此，植物多糖的提取及特性研究對其開發(fā)利用和臨床應用具有重要意義。從植物中提取多糖的常見方法有熱水提取法、酸堿提取法和酶解提取法。這些方法都有一定的局限性，熱水提取法所需能耗較高， 而且在提取過程中， 加熱會導致多糖鏈的斷裂;酸堿提取法會將植物中的生物堿或酸性物質一起提取出來，造成所提取的多糖純度低，還需要進一步的純化;酶解提取法的不僅成本較高，同時也會將部分多糖降解，造成多糖提取率降低[12]。近年來多種新興技術應用于多糖提取，例如：超聲、微波、超高壓輔助溶劑浸提和超臨界流體萃取等[13]。其中，超聲波屬于機械振動波，其空化效應、熱效應、機械效應能將植物多糖有效地從細胞內部分離出來，而不破壞多糖的結構，糖活性損失小。同時，超聲輔助提取技術還具有提取時間短、提取率高等優(yōu)點[14]。楊芳等[15]研究板栗多糖的超聲提取，在最優(yōu)條件下，板栗多糖的提取率是傳統(tǒng)熱水提取法的2.23倍，時間縮短了1.5倍。

超聲提取過程是一個復雜的提取和傳質過程。超聲提取過程中，最主要的影響因素為超聲功率，超聲時間和液固比[16]。本研究根據Box-Behnken 試驗設計原理和響應面分析方法，利用Design Expert 軟件進行試驗設計和統(tǒng)計分析，以藍莓多糖提取率為指標，得到了藍莓多糖提取率與超聲功率、提取時間和液固比的回歸模型。本研究結果表明，超聲功率對多糖提取率影響較為明顯，多糖提取率隨超聲功率的增加先增加后降低。這主要是因為較低的超聲功率范圍內，提高超聲功率有利于破壞植物細胞壁和促進提取溶液的傳質，從而提高多糖提取率;當超過某一臨界值時，超聲波產生的剪切力強度過高，反而引起多糖分子結構的破壞，進而導致多糖提取率下降[16]。魏明等[17]在米糠多糖的超聲提取過程中，多糖最佳提取功率為200 W，升高或降低超聲功率都會導致多糖提取率下降。不同來源的多糖最佳提取功率不同，F(xiàn)u等[18]研究超聲提取樺褐孔菌多糖，最佳提取功率為100 W。由于超聲法是利用超聲波的機械剪切作用來提取多糖，超聲時間過長可致多糖分子結構的改變，從而降低多糖的提取率及活性，因此超聲時間也是影響多糖提取率的一個重要因素[19]。液固比影響著植物顆粒與超聲場的接觸范圍、超聲波的輻射半徑及溶液黏度，在一定范圍內提高液固比有助于提高多糖提取率[16]。但黃秀香等[20]發(fā)現(xiàn)當液固比超過一定值時，半枝蓮多糖提取率達到最大值后開始下降。本研究最佳提取功率為600 W，最佳的超聲時間為87 min，最佳液固比為49 mg/g。在最優(yōu)條件下，藍莓多糖提取率理論值為4.93%，驗證實測值為4.91%。經驗證該模型是合理可靠的，能夠較好地預測超聲法提取藍莓多糖的得率。本研究結果為進一步研究藍莓多糖提供了應用及理論基礎。

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