HPLC—ELSD法測定肉制品中山梨糖醇

甘凝嵐

摘 要：建立肉制品中山梨糖醇的高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector，HPLC-ELSD）測定法。實驗采用乙腈-水溶液（7∶3，V/V）作為流動相直接超聲提取樣品，經Agilent ZORBAX NH2（4.6 mm×250 mm，5 ?m）色譜柱分離，蒸發光散射檢測器檢測；優化ELSD檢測器參數為飄移管溫度90 ℃，氮氣流速2.0 L/min。結果表明：山梨糖醇含量在0.2～5.0 mg/mL范圍內有良好的線性，方法相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在1.28%～2.02%之間，回收率在88.3%～99.0%之間。本方法具有樣品前處理簡便、方法檢出限低、方法重現性好的特點，適用于肉制品中山梨糖醇含量的測定。

關鍵詞：山梨糖醇；肉制品；高效液相色譜-蒸發光散射法

Determination of Sorbitol in Meat Products by HPLC-ELSD

GAN Ninglan

（Jiangsu Product Quality Testing and Inspection Institute， Nanjing 210007， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detection （HPLC-ELSD） method was developed for the determination of sorbitol in meat products .The samples were ultrasonically extracted using acetonitrile water （7：3， V/V） as mobile phase and separated on ZORBAX NH2 Agilent column， then detected by evaporative light scattering detector （ELSD）. Optimized ELSD detector parameters such as drift tube temperature and nitrogen flow rate were set at 90 ℃ and 2.0 L/min， respectively. The results showed that sorbitol displayed good linearity relationship over the concentration range of 0.2 to 10 mg/mL. The method precision （relative standard deviation， RSD） ranged from 1.28% to 2.02%， and the recovery was between 88.3% and 99.0%.This method has the advantages of simple sample pretreatment， low detection limit and good reproducibility. So it is useful for the determination of sorbitol in meat products.

Key words： sorbitol； meat products； high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector （HPLC-ELSD）

中圖分類號：O657.7 文獻標志碼：A 文章編號：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

山梨糖醇又名山梨醇、薔薇醇、清涼茶醇、六羥基醇[1]，主要是由葡萄糖催化加氫法和淀粉糖化直接加氫法生產，也可用蔗糖為原料進行生產[2]。山梨糖醇在食品工業中功能性很多，主要包括高黏性（促使食品增濃與定型）、吸濕性（使食品有潤滑性和柔軟性）、甜味或涼爽的味覺、多價螯合劑、結晶改性劑（延遲結晶）和膨黏性能等[3]。因此，山梨糖醇的添加可使食品在整個保質期內各種品質都保持不變。山梨糖醇是一種半天然、營養型甜味劑，其甜度只有蔗糖（食糖）的60%，其發熱量也比食糖降低了1/3，是一種非生齲性物質，現已廣泛用于糖尿病人專用的無糖型食品[4]。研究發現，在肉制品的加工過程中，山梨糖醇的添加能夠增強肉制品體系對外加水分和自身水分的保持，提高體系的持水力，可以作為一種優異的持水劑使用。例如，在相同的加工時間內山梨糖醇的添加能夠降低肉制品的水分活度，有利于產品的貯藏；添加山梨糖醇還可以顯著縮短產品的生產周期，提高產品的得率及水分含量；同時，山梨糖醇的添加也能改善產品的品質，使其硬度降低，更易咀嚼[5]。近年來，部分肉制品生產商開始在肉制品的加工過程中加入山梨糖醇，作為持水劑使用。

據報道，美國要求在相應食品包裝上說明，山梨糖醇最大日攝入量為50 g。歐洲要求當糖醇使用比例超過10%時，則須在相應食品包裝上說明可能引起輕度腹瀉。我國現有的食品安全國家標準GB2760—2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規定肉制品中不得添加山梨糖醇，而調味品中的山梨糖醇可以“按生產需要適量使用”，但沒有明確限制其添加量。肉制品中常使用調味料來改善口感，若肉制品中測得山梨糖醇則必須符合帶入原則，且不得對食用者造成損害。由于內服過量的山梨糖醇，會導致食用者腹瀉和消化紊亂，因此需要建立檢測肉制品中山梨糖醇的分析方法，為肉制品行業的規范發展提供標準依據。

目前，檢測山梨糖醇常用的方法有高效液相色譜法[6-11]、液質聯用法[12-14]、氣相色譜法[15-18]、氣質聯用法[19]、離子色譜-質譜聯用法[20]、離子交換色譜-脈沖安培法[21]等。示差折光檢測器對外部環境要求較高，實驗室的溫度、濕度以及流動相的流速都會對其有較大影響，因此，實驗過程要求相對嚴格。用氣相色譜法檢測山梨糖醇前必須對山梨糖醇經行衍生化處理，但是這種處理很容易改變山梨糖醇的性質。離子色譜法用于山梨糖醇含量的檢測研究較多，其靈敏度較好，但是山梨糖醇在電極表面會發生氧化還原反應，從而影響方法的準確性。運用質譜檢測器檢測山梨糖醇，雖然靈敏度高，但樣品前處理操作復雜。本實驗選用蒸發光散射檢測器法，具有樣品處理簡單、基線穩定、檢出限低、針對性強等優點。本方法的建立旨在為肉制品中山梨糖醇含量的測定做出基礎性的探索工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香腸制品、火腿腸、豬肉脯、牛肉干、醬鹵肉等共10 批次市售樣品均購于南京各大超市。

乙腈（色譜純） 美國Tedia公司；去離子水 美國Millipore公司；山梨糖醇（99%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

AL204型電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；A25實驗室高剪切分散乳化機 上海喬榮電子科技有限公司；XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；KQ-300E型超聲波清洗機 昆山市超聲波儀器有限公司；Heraeus Multifuge XIR型離心機 美國Thermo Fisher公司；1260型高效液相色譜儀、380型蒸發光散射檢測器 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取5.00 g粉碎后的肉制品于50 mL具塞離心管中，準確加入20.0 mL流動相，渦旋混合均勻，超聲提取30 min，以8 000 r/min離心3 min，取適量上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液待上機分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（7∶3，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：40 ℃；進樣體積：10 μL；漂移管溫度：90 ℃；氮氣流速：2.0 L/min。

1.3.3 標準溶液配制

1.3.3.1 標準儲備液的配制

精確稱取山梨糖醇標準品100.00 mg于10 mL容量瓶中，配制成質量濃度為10 mg/mL的標準儲備液。

1.3.3.2 標準工作液的配制

分別準確吸取不同體積山梨糖醇的標準儲備液，將其用水稀釋成質量濃度為0.2、0.5、1、2、4、5 mg/mL的標準工作液。進行高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector，HPLC-ELSD）檢測，根據樣品的保留時間進行定性分析。

2 結果與分析

2.1 測定條件的優化

2.1.1 樣品前處理方法的優化

由于肉制品中的基質較為復雜，其中蛋白質和油脂含量較高，在前處理過程中要盡量去除這些雜質，同時也要保證樣品中山梨糖醇的提取率。實驗比較了3 種前處理方法：方法1為參照GB/T22222—2008《食品中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的測定 高效液相色譜法》，樣品要經石油醚去脂，蒸發凈石油醚，加入去離子水超聲提取，再加入沉淀劑沉淀蛋白，濾紙過濾，濾液再經0.45 ?m微孔濾膜過濾，待上機檢測；方法2參照SN/T 3142—2012《進口食品中D-甘露糖醇、麥芽糖、木糖醇、D-山梨糖醇的檢測方法 液相色譜-質譜法》，樣品用去離子水超聲提取后，將提取液用容量瓶定容，再取出部分提取液經Oasis HLB固相萃取柱凈化洗脫，最后經0.22 ?m濾膜過濾，待上機檢測；方法3為樣品經流動相乙腈-水（7：3，V/V）超聲提取，離心后直接經0.22 ?m濾膜過濾，待上機檢測。

圖1 不同方法的實驗結果

Fig. 1 Effect of pretreatments on sorbitol recovery

由圖1可知，方法1由于沉淀劑易干擾目標物山梨糖醇的提取，使得其回收率較低；雖然方法2的回收率較方法1高，但步驟繁瑣，耗時較長；而方法3的回收率較高，且操作簡單，因此，選用方法3作為本實驗的前處理方法。

2.1.2 檢測器的選擇

參照GB/T22222—2008《食品中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的測定 高效液相色譜法》運用示差折光檢測器檢測山梨糖醇，該方法儀器系統平衡時間較長、檢測過程中基線易飄移、方法檢出限較高，實驗對檢測環境和流速要求較高且方法重現性較差。采用蒸發光散射檢測器檢測山梨糖醇，檢測系統穩定性較好、儀器檢出限較低、方法重現性較好。因此本方法選用蒸發光散射檢測器檢測肉制品中的山梨糖醇。

2.1.3 ELSD參數的優化

ELSD檢測主要受到2 個重要參數的影響：漂移管溫度和載氣（N2）流速。比較漂移管溫度分別為80、85、90、95、100 ℃時，載氣（N2）流速分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3 L/min時對山梨糖醇響應強度的影響。

圖2 不同漂移管溫度（a）和不同氮氣流速（b）條件下山梨糖醇的響應強度

Fig. 2 Response intensity of sorbitol at different drift tube temperatures （a） and different nitrogen flow rates （b）

由圖2可知，在一定范圍內，漂移管溫度越高，山梨糖醇的響應越好，信噪比越大，當漂移管溫度過高達到95 ℃以上時，山梨糖醇的響應反而下降，信噪比減小；隨著氮氣流速的提高，山梨糖醇的響應越好，信噪比也不斷增大，在流速達到2.0 L/min以后，山梨糖醇的響應強度變化趨于平衡。因此，最終選擇最適用于山梨糖醇檢測的ELSD參數設置條件：漂移管溫度為90 ℃，載氣流速為2.0 L/min。

2.2 方法的驗證

2.2.1 最低檢出限和定量限

以空白肉制品，經1.3.1節處理后，儀器進樣10 μL時，山梨糖醇標準溶液最低檢出限為8.0 μg/mL，最低定量限為25 μg/mL。

2.2.2 工作曲線和線性范圍

取配制好的山梨糖醇標準工作液，上機檢測，以山梨糖醇標準溶液的峰面積計算其對數為縱坐標，以其質量濃度對數為橫坐標，繪制標準曲線得到線性回歸方程：y=1.25x-7.31，相關系數為0.999 2，線性范圍為0.2～5.0 mg/mL。

2.2.3 精密度實驗

吸取山梨糖醇標準工作液0.2、1、5 mg/mL，各質量濃度均進樣6 次，以峰面積計算精密度。由表1可知，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）介于1.28%～2.02%之間，精密度良好。

2.2.4 回收率

1 mg/mL山梨糖醇標準溶液、空白牛肉干樣品、牛肉干樣品1mg/mL山梨糖醇加標色譜圖如圖3所示。取不含有山梨糖醇的空白牛肉干9份，按0.2、1、5 mg/g 3種加標水平加標，經1.3.1節方法處理樣品后，按1.3.2節條件用儀器檢測，由表2可知，回收率在88.3%～99.0%之間，RSD%均小于5.0%，符合分析要求。

2.2.5 雜質對目標物質的干擾

經實驗發現，肉制品中常用添加劑如防腐劑、著色劑、抗氧化劑等，這些雜質在運用本方法的處理、分析條件時，都沒有對山梨糖醇的檢測產生干擾，結果見圖4。

2.3 未知肉制品中山梨糖醇含量的測定

利用本方法對南京各大超市銷售的10 批次肉制品（包括香腸制品、火腿腸、豬肉脯、牛肉干、醬鹵肉等）進行檢測，檢測結果見表3。經檢測，所檢樣品中有4 批次產品檢出山梨糖醇。

3 結 論

采用高效液相色譜法氨基柱分離、蒸發光散射檢測器檢測肉制品中的山梨糖醇。結果表明，本方法可以基本排除肉制品中常見添加劑的干擾，若檢出陽性樣品，可根據檢出量的大小來判斷：含量不高則因添加調味料而帶入的可能性較大；含量過高則生產時人為添加的可能性較大。該方法利用70%乙腈-水提取樣品，不僅能沉淀蛋白質而且脂肪提取物和溶出雜質較少，有效縮短了前處理時間，提高了回收率，同時針對山梨糖醇優化了ELSD參數，使得此方法具有前處理簡便、檢出限低、重現性好、針對性強的特點，可以準確、高效地測定肉制品中的山梨糖醇的含量。

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