硅膠固相萃取—高效液相色譜法檢測油炸肉制品中的丙烯酰胺

鄭衛 徐世明 趙瑞連 張建梅 郭光平 孫承鋒 王光杰

摘 要：實驗建立一種利用硅膠固相萃取-高效液相色譜來檢測油炸肉制品中丙烯酰胺的含量的方法。采用硅膠作為萃取材料對樣品提取液進行凈化，利用高效液相色譜進行檢測。結果表明：檢測波長為205 nm，流動相為甲醇-水（5∶95，V/V），流速為0.8 mL/min。方法加標回收率為73.5%～80.8%，相對標準偏差≤5.54%，最低檢出限為10 ng/mL。該方法簡便、可靠，滿足油炸肉制品中丙烯酰胺的檢測要求。

關鍵詞：油炸肉制；硅膠；固相萃取；高效液相色譜

Detection of Acrylamide in Fried Meat Products by Silica Gel Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Wei1， XU Shiming2，*， ZHAO Ruilian2， ZHANG Jianmei2， GUO Guangping2， SUN Chengfeng1，

WANG Guangjie2

（1.Institute of Food Science and Engineering， Yantai University， Yantai 264005， China；

2.Yantai Xiwang Food Co. Ltd.， Yantai 264002， China）

Abstract： This paper presents a silica gel solid phase extraction-high performance liquid chromatography （HPLC） method to detect the content of acrylamide in fried meat products. The extract was cleaned up by solid phase extraction using silica gel as the adsorbent prior to being analyzed by HPLC. The detection wavelength was set at 205 nm. The separation was performed using a Kromisil C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase used was a 5：95 （V/V）mixture of methanol and water at a flow rate of 0.8 mL/min. Recoveries of the proposed method for spiked samples ranged from 73.5% to 80.8%， with relative standard deviation （RSD） no greater than 5.54% （n = 5）. The limit of detection was 10 μg/mL （S/N = 3）. This method is simple and reliable， and can be used for the detection of acrylamide in fried meat products.

Key words： fried meat products； silica gel； solid phase extraction； high performance liquid chromatography （HPLC）

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

丙烯酰胺是一種極性小分子物質，相對分子質量為71.08，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮[1]，微溶于乙酸乙酯，不溶于苯基庚烷[2]。2002年瑞典科學家首次在食品中發現丙烯酰胺[3]，由于丙烯酰胺對人體有潛在致癌性[4-6]、神經毒性[7-9]、生殖毒性[9-10]等多重毒性[11]，而引起了各國科研人員的關注，進而掀起了研究丙烯酰胺的熱潮。目前關于丙烯酰胺的研究大多集中于薯類[13-14]及淀粉類食品[15-17]，肉類制品的研究較少。由于肉制品由于富含蛋白質，也含有氨基酸和糖類物質，在高溫加工過程中發生美拉德反應而產生丙烯酰胺[18]，因此油炸肉制品中丙烯酰胺含量的研究具有實際意義。章宇等[19]利用液相色譜-串聯質譜法檢測了兩組油炸雞翅中丙烯酰胺的含量，結果分別為146.6 μg/kg和213.5 μg/kg，陳旭明等[20]利用氣相色譜-質譜聯用法檢測了炸雞腿及炸雞骨中丙烯酰胺的含量，檢測結果分別為365 μg/kg和703 μg/kg。

目前丙烯酰胺的主要檢測方法是氣相色譜-質譜聯用[21-22]和液相色譜-質譜聯用[23-24]。氣相色譜-質譜聯用需要衍生，實驗耗時長，操作繁瑣；液相色譜-質譜聯用費用昂貴，不利于推廣[25]。實驗以油炸肉制品為研究對象，建立了一種硅膠固相萃取-高效液相色譜檢測油炸肉制品中丙烯酰胺的方法，該方法簡便、可靠，滿足油炸肉制品中丙烯酰胺的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油炸肉制品購自學校周邊市場。

丙烯酰胺標準品（≥99.9%） 中國計量科學研究院；甲醇（液相色譜級） 德國默克股份公司；硅膠（分析純） 青島邦凱分離材料有限公司；針式過濾頭（0.22 ?m，有機相） 上海安譜科學儀器有限公司；超純水自制。

1.2 儀器與設備

Agilent1100高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；分析天平 德國賽多利斯集團；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；TG16-WS離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；粉碎機 青島漢尚電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準確稱取適量粉碎均勻的樣品于錐形瓶中，加入40 mL正己烷振蕩10 min以除去脂肪，棄去正己烷，并揮發干殘余的正己烷，加入40 mL甲醇溶液，振蕩提取30 min，重復提取2 次，合并提取液，6 000 r/min離心15 min，將上清液轉移入平底燒瓶中，用旋轉蒸發儀蒸干，加入30 mL乙酸乙酯提取，重復2 次，合并乙酸乙酯溶液于錐形瓶中，加入3.0 g硅膠，50 ℃條件下萃取1.0 h，蒸干乙酸乙酯，得到萃取后的硅膠，用60 mL甲醇分3 次對所得到的硅膠進行洗脫，收集洗脫液并用旋轉蒸發儀濃縮，定容至5 mL，高效液相色譜檢測前用0.22 ?m有機相濾膜過濾。

1.3.2 高效液相色譜檢測條件

色譜柱：Kromisil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-水（5∶95，V/V）；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 ?L；柱溫：40 ℃；檢測波長：205 nm。依據保留時間進行定性，峰面積進行定量。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確立

2.1.1 檢測波長的確定

用紫外分光光度計對5.0 μg/mL的丙烯酰胺標準溶液在190～300 nm波長范圍內進行連續檢測，根據得到的連續吸光度變化圖，得知丙烯酰胺在205 nm附近有最大吸收值，由于高效液相色譜儀上的紫外檢測器與紫外分光光度計存在差異，因此再利用高效液相色譜對丙烯酰胺標準溶液205 nm和210 nm進行檢測，由圖1可知，205 nm處峰面積明顯比210 nm要大，因此選擇205 nm作為丙烯酰胺的檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

分別用超純水、甲醇-水（3∶97，V/V））、甲醇-水（5∶95，V/V）作流動相進行檢測，觀察峰型及保留時間，超純水作流動相時峰寬較大，此外純水作流動相對C18色譜柱會產生不良影響；甲醇-水（3∶97，V/V）時，峰型尚好，但是對樣品進行檢測時，試樣中的丙烯酰胺未能分離出來；甲醇-水（5∶95，V/V）時，峰型良好，也能將試樣中的丙烯酰胺分開，因此選擇流動相為甲醇-水（5∶95，V/V）。

2.1.3 流速的選擇

通過設置流速0.5、0.8、1.0 mL/min比較3 種流速對丙烯酰胺保留時間、峰型的影響，由圖2可知，流速對保留時間、峰型有影響，流速增大，保留時間減小；流速降低，保留時間變大，峰寬增大。0.5 mL/min時，峰寬較大，保留時間較大，而1.0 mL/min時，保留時間偏小，因此流速選擇0.8 mL/min。

2.2 樣品預處理條件的優化

通過對水、甲醇、乙醇3 種提取溶劑進行對比，結果表明，乙醇在丙烯酰胺保留時間處有峰出現，因此排除乙醇，水及甲醇均對檢測無干擾，考慮到用甲醇提取后更利于濃縮，故選取甲醇提取溶劑。然后采用固相萃取法對提取液進行凈化，實驗比較了活性炭、C18和硅膠3種固相材料的萃取效果，結果表明硅膠的萃取和凈化效果最好，因此實驗選擇硅膠作為凈化材料。

2.3 標準曲線的繪制

取適量丙烯酰胺標準使用溶液配制成質量濃度分別為5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 ?g/mL的標準溶液，過膜后進行檢測，丙烯酰胺保留時間為6.02 min。以各質量濃度丙烯酰胺標準所得峰面積為縱坐標，以相應的質量濃度為橫坐標作曲線，標準曲線方程為y=232.48x-3.014 6，R2=0.999 6。曲線方程顯示丙烯酰胺質量濃度在0.1～5.0 ?g/mL范圍內線性關系良好，

2.4 精密度、回收率與檢出限

選擇0.1、1.0、5.0 ?g/mL這3 個質量濃度的標準溶液，分別連續進樣5 次，計算得到3 個質量濃度測定的相對標準偏差，結果如表1所示。分別取含有3、5、7 ?g的丙烯酰胺的標準溶液按照樣品提取方法進行提取、凈化并進行檢測，計算其回收率，結果如表2所示。

實驗以3 倍信噪比（RS/N）作為基準，取低質量濃度的標準溶液逐級稀釋，測得丙烯酰胺的最低檢測限為10 ng/mL。

2.5 實際樣品檢測

按照1.3.1節的前處理方法對樣品進行前處理，然后在1.3.2節高效液相色譜條件下進行檢測。實際樣品的丙烯酰胺含量檢測結果如表3所示。

3 結 論

本實驗采用硅膠固相萃取-高效液相色譜法檢測油炸肉制品中的丙烯酰胺。利用硅膠作為固相萃取材料對樣品提取液進行凈化，較好的去除雜質的干擾；通過對高效液相色譜檢測條件進行優化，使得樣品中丙烯酰胺得到了較好的分離。方法的加標回收率為73.5%～80.8%，相對標準偏差≤5.54%，最低檢出限為10 ng/mL，滿足油炸肉制品中丙烯酰胺的檢測要求。

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