聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對穿心蓮種子的鑒定

盧培培

摘 ?要：本鑒定旨在探討SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對穿心蓮種子進行鑒別的可行性，為穿心蓮種子鑒別及育種研究提供科學依據。本鑒定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，對幾種不同來源和不同采收期的穿心蓮種子進行可溶性蛋白質電泳研究。結果表明：不同產地的穿心蓮種子蛋白質電泳圖譜之間在譜型和譜帶的強弱、蛋白質相對含量上均有一定的差異，不同采收期穿心蓮種子蛋白質電泳在蛋白質譜帶的強弱上有一定差異。結論是聚丙烯酰胺凝膠電泳技術可用于穿心蓮種子鑒定。

關鍵詞：聚丙烯酰胺凝膠電泳技術 ?穿心蓮 ?種子鑒定

穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees為爵床科植物，具有清熱解毒、涼血消腫等功能，臨床上常用于急性菌痢、胃腸炎、感冒、流腦、氣管炎、高血壓等疾病的治療。研究表明，不同產地、不同采收期的穿心蓮性狀、成分差異較大，種子混雜現象也較嚴重。中藥材種子所含蛋白質的種類和數量攜帶了其長期演化的遺傳特征，具有很高的穩定性和專屬性，其真偽和品種鑒別是中藥集約化生產的重要環節和前提。1991年國際種子檢驗協會將蛋白質電泳方法正式定為標準的品種鑒定方法。目前，蛋白質電泳技術迅速發展和日臻完善，但大多應用于玉米、棉花等植物中，應用于藥用植物的研究尚為數不多。鑒定收集了幾種不同產地和不同采收期的穿心蓮種子，利用蛋白質電泳技術對其進行檢測，旨在為穿心蓮種質資源的保護、評價，種子的鑒定及育種提供參考依據。

一、鑒定的材料與方法

1.材料。采集4個不同地區和同一地區3種不同采收期的成熟穿心蓮果實，室溫下陰干，待果皮自然裂開彈出種子，收集于種子瓶中置室溫陰涼處保存。

2.儀器與試劑。鑒定所用儀器：DYY-11型電泳儀，DYCZ-24DN雙垂直平電泳槽，TDL80-2B臺式離心機、HK3300H超聲波清洗器，PHS-30酸度計，HC-TP12-2型架盤藥物天平。鑒定所用試劑：甘油，1%（質量濃度）溴酚藍，考馬斯亮藍R-250染液（取0.04 g考馬斯亮藍R-250，加入甲醇18 mL、蒸餾水18 mL和冰醋酸4 mL，即得），考馬斯亮藍脫色液（10 mL甲醇、10 mL冰醋酸和80 mL蒸餾水混勻），30%（質量濃度，下同）丙烯酰胺，0.8%N，N-甲叉雙丙烯酰胺，10%SDS，10%過硫酸銨，1%溴酚藍。

3.方法

3.1 樣品緩沖液的制備取1 mol·L-1的Tris-HCl 0.6 mL，加入50%（體積分數）的甘油5 mL、10%（體積分數）的SDS 2 mL、 2-硫基乙醇0.5 mL、1%（質量分數）溴酚藍1 mL和蒸餾水0.9 mL，4 ℃冰箱中存放，備用。

3.2 丙烯酰胺儲存液100 mL（A液）30%丙烯酰胺、0.8%雙丙烯酰胺。

3.3 ?4×分離膠緩沖液100 mL（B液）2 mol·L-1Tris-HCl 75 mL、10%SDS 4 mL，蒸餾水21 mL。

3.4 ?4×濃縮膠緩沖液100 mL（C液）取1 mol·L-1 Tris-HCl 50 mL，加入10%SDS 4 mL，再加入蒸餾水46 mL，即得。

3.5 ?5%濃縮膠蒸餾水2.3 mL，A液0.67 mL，C液1.0 mL，10%過硫酸銨30 μL，TEMED 5 μL。

3.6 ?12%分離膠A液4 mL，B液2.5 mL，蒸餾水3.5 mL，10%過硫酸銨50 μL，TEMED 5 μL。

3.7樣品溶液的制備[8]取穿心蓮種子0.5 g，加入稀釋5倍的樣品緩沖液（pH6.8）2 mL，3%聚乙烯毗咯烷酮（PVP），冰浴下研磨，加入稀釋4倍的5%濃縮膠緩沖液1 mL，振搖，混勻，超聲20 min，室溫離心20 min（4 000 r·min-1）。取上清液，離心20 min（4 000 r·min-1）， 取上清液， 加入石油醚 2 mL，振搖2 min，靜止分層。吸取下層液體，加入適量冷丙酮，振搖，置4 ℃冰箱30 min，取出，離心5 s（4 000 r·min-1），棄去丙酮，風干。沉淀物加入樣品緩沖液2～3 mL，振搖2 min，超聲5～10 min，待溶解完全后，室溫下離心5 min（4 000 r·min-1），取上清液，置4 ℃冰箱中存放，備用。

3.8 電泳緩沖液的配制取Tris堿3 g、甘氨酸14.4 g和SDS 1 g， 加入蒸餾水至1 L， pH 8.3， 在 4 ℃冰箱中存放，備用。

3.9 電泳操作采用1 mm厚的SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度12%，電極緩沖液為Tris-甘氨酸，pH8.3。用微量注射器分別取樣品液25 μL，注入樣品槽底部，點樣結束后向上槽內加入1滴溴酚藍指示劑示蹤。起始電壓控制在120 V，樣品進入分離膠后，電壓調整為200 V，待指示劑距前沿約1 cm時，停止電泳，迅速取出膠板，標記前沿。

3.10 染色和脫色取出膠板后，用蒸餾水沖洗，隨即放入考馬斯亮藍 R250顯色液中，置恒溫箱中38 ℃染色2 h 后取出，多次更換脫色液（甲醇10 mL、冰醋酸10 mL和蒸餾水80 mL），至背景清晰為止。拍照、記錄。

二、鑒定結果與分析

1.電泳結果不同產地和不同采收期的穿心蓮種子蛋白的SDS-PAGE電泳結果制成圖表，根據此繪制成電泳圖譜。結果顯示，不同來源、同一產地不同采收期的穿心蓮種子可溶性蛋白質電泳圖譜共有11條共有特征帶，且譜帶清晰，Rf值分別為：0.460、0.471、0.482、0.495、0.512、0.524、0.538、0.825、0.921、0.937，表示其具有的共同遺傳基礎，可作為鑒定穿心蓮種子的重要標記。以一級帶、二級帶作為主要分析特征，不同產地及不同采收期的穿心蓮種子蛋白質譜帶具有多條共同譜帶，但白云基地采收種子的電泳譜帶數目與其他種子有較大差異，有10條特征帶。在三級帶、四級帶和五級帶上，一些譜帶的數目、遷移率有一定差異。

2.蛋白相對百分含量為了分析蛋白表達量，利用凝膠圖像分析軟件Band Scan對電泳蛋白圖譜進行分析，其中由于有部分譜帶的灰度值太低，難以測出其所在區域的蛋白含量。可測得的目的蛋白占總蛋白的百分數結果較為復雜。a～f.分別是編號為a～f的穿心蓮種子，穿心蓮種子可溶性蛋白電泳圖譜顯示清晰，穿心蓮種子可溶性蛋白電泳圖譜分析圖結果表明，不同來源地和不同采收期的穿心蓮種子蛋白表達量亦存在差異。

三、討論

穿心蓮通常是種子繁殖，故種子的鑒定及其品質極為重要。蛋白質是基因表達產物，具有一定的穩定性，但亦會受環境的影響而發生基因的變異，形成不同的生態型甚至變種。本研究首次利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，對4個不同來源地的穿心蓮種子及同一產地不同采收期的穿心蓮種子水溶性蛋白進行了蛋白質電泳的初步研究。研究結果表明，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術可作為鑒定穿心蓮種子的生物指征。此外，同一來源不同采收期的穿心蓮種子蛋白質電泳圖譜在譜帶數目、遷移率上具有較高相似性，在蛋白質相對含量上則呈現出一定的差異，提示可以作為穿心蓮種子成熟以及最佳采收期的生化標記，相關的研究將在下一步工作開展。為穿心蓮種子可溶性蛋白電泳的蛋白表達量提供了數據。本研究表明了利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對穿心蓮種子進行鑒定及種子品質研究的可行性，為進一步研究穿心蓮種質資源的保護、評價及育種提供參考依據。