組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）的分類及結構特點

周向培

隨著生命科學的深入發展，對腫瘤的致病和發病機制的分子生物學研究為開發低毒高效針對特異性分子靶標的抗腫瘤藥物提供了基礎。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）是維持染色體的基本組成單位核小體中組蛋白乙酰化平衡的關鍵酶類之一，其催化組蛋白的去乙酰化作用，與基因轉錄抑制密切相關，牽涉到促基因沉默的諸多過程，是抗腫瘤藥物設計中的熱門靶標。本文就此談談組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）的分類及結構特點。

一、組蛋白去乙酰化酶的分類

基于酵母種系發育中的不同HDACs的結構同源性分析，真核生物HDACs被分成4類：Ⅰ類HDACs與酵母Rpd3具有同源性，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8;Ⅱ類HDACs與酵母Hda1具有同源性，包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10，其根據催化區域的不同又可分為2類：Ⅱa類具有一段催化區域，包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9，Ⅱb類具有兩段催化區域，主要包括HDAC6和HDAC10;Ⅲ類HDACs即沉默信息調節因子2（silent information regulator2，Sir2）-相關酶類 （Sir2-related enzymes，sirtuins），其是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的組蛋白去乙酰化酶類;Ⅳ類HDACs主要是HDAC11，其與Ⅰ、Ⅱ類HDACs差異較大而被獨立劃歸一類。HDACs家族各成員主要定位于細胞核與細胞質中，另有少部分定位于胞質細胞器如線粒體中（主要是Ⅲ類HDACs中的SIRT3、SIRT4與SIRT5），HDACs發揮催化作用的目標蛋白種類繁多，常見如抑癌蛋白p53、熱休克蛋白HSP70、Smads蛋白家族等，HDACs正是通過與催化多種生理過程中的關鍵蛋白而在調控腫瘤進程中發揮重要作用。

二、組蛋白去乙酰化酶的結構特點

1.Ⅰ類HDACs

Ⅰ類HDACs中的HDAC1已被研究證實，其磷酸化可以促進酶本身的催化活性及催化復合物形成，磷酸化發生于HDAC1中421位絲氨酸位點Ser421與423位絲氨酸位點Ser423。運用K-trap（K-抗酒石酸酸性磷酸酶）親和樹脂對HDAC1進行純化，SDS-PAGE（聚丙烯酰氨凝膠電泳）分離K-trap純化的HDAC1，考馬斯亮藍染色檢測蛋白，運用質譜法鑒定磷酸化基團，顯示HDAC1分子量標識物大小分別為75 000、66 000，其他種Ⅰ類HDACs即HDAC2、HDAC3與HDAC8蛋白鑒定分析應用Clustal法完成，HDAC1、HDAC2、HDAC8分別由482、488、377種氨基酸構成。

2.Ⅱ類HDACs

（1）Ⅱa類HDACs，研究證實，Ⅱa類HDACs一段保守的鋅結合域——HDAC4催化序列與Ⅰ類HDACs相區別的特征是一段鋅離子結合域，其容納了2種自分子中心分離的蛋白片段。第1個片段形成了1個17-氨基酸環（Lα1-α2），其貢獻了3個鋅離子配體：His665，Cys667，和His678（圖1A）。第2個片段是1含35個殘基的插入體（α6-α7-β3-β4），形成了1個螺旋結構，緊接著1個包含其尖端第4鋅配體Cys751的β-發夾結構。值得注意的是，這4個鋅配體在所有的Ⅱa類HDACs中均高度保守，但在其他種類的HDACs中缺失。此鋅結合域與環結構方面不同點的存在導致HDAC4相比HDAC8及HDAH擁有一個更活躍的活性位點。同時，在HDAC8、HDLP及HDAH中并不存在催化醋酸鹽反應產物釋放的水性通道。

晶胞分析的結果顯示，在位于鋅結合域的Cys669與來自于鄰近分子的Cys700之間，有一分子內部的二硫鍵形成。為排除此二硫化物對抑制物與活性位點間作用可能的影響，對野生型（WT型）HDAC4與HDAC4催化序列功能性突變體（GOF-HDAC4cd）（包括含有C669A/C700A兩個突變體與C700A單一突變體）的抑制物結構均進行了論證，結果顯示突變體的結構與相應的無突變的野生型及排除紊亂狀態下的鋅結合域突變體蛋白相同。證明HDAC4cd-抑制劑復合物的結構域在空間彎曲折疊，且分子內部的二硫帶在某些部位已將其封閉。

（2）Ⅱb類HDACs，有研究證實，Ⅱb類HDACs的HDAC10是一種含有669個氨基酸殘基的多肽，其由N-末端的Hda1相關去乙酰化序列與C-末端的亮氨酸富集序列構成組合式的結構。有關圖中顯示，HDAC10的去乙酰化序列（DAC）用白框表示，亮氨酸富集序列（LRD）用陰影框來闡明。另HDAC10的去乙酰化序列與HDAC6對應的區域的相同及相似度亦在圖中反映，即HDAC10兩段乙酰化序列與HDAC6的對應序列的相同/相似度分別為54%/62%與53%/60%。詳見1HDAC4結合態的催化序列結構模式圖Figure 1Structural diagram of catalytic sequences of HDAC4 in bound state Ⅱb類HDACs的HDAC10序列及與HDAC6比較Figure 2Sequence comparison of HDAC10 and HDAC6。

3.Ⅲ類HDACs

哺乳動物有7種Sir2-related enzymes，sirtuins，即Ⅲ類HDACs，包括SIRT1-7。所有成員均含有一段NAD+依賴的催化核序列，其扮演著單-ADP-核糖基轉移酶（mono-ADP-ribosyl transferase （ART））或者NAD+依賴的去乙酰化酶（DAC）的角色，此催化序列兩端環繞著可變長度的N-末端與C-末端序列，在細胞內不同的sirtuins其定位不同。有關圖中顯示，SIRT1與SIRT5只具有DAC活性，SIRT4與SIRT6只具有ART活性，而SIRT2與SIR3具有DAC與ART兩種活性;在細胞定位方面，SIRT1主要定位于常染色質中，SIRT2重要定位于細胞質中，SIRT3-SIRT5則主要定位于細胞線粒體中，而SIRT7則定位于細胞核仁中。詳見Ⅲ類HDACs各成員功能、胞內定位及大小比較Figure 3Comparison of function，intracellular localization，and size of Class Ⅲ HDACs。

4.Ⅳ類HDACs，研究人員運用cDNA克隆預測到人類HDAC11氨基酸序列，揭示了HDAC11擁有347個氨基酸的開放閱讀框（對應分子量為39 000）。基因數據庫的專家預測HDAC11基因定位于人類3p25.2染色體，長度上跨越25 kb，包含9個外顯子與8個內含子，在氨基酸水平的序列比較顯示：HDAC11的整個蛋白組成與已知的HDACs家族成員（HDAC1-HDAC10）僅有微小的同源性（包括酵母菌HOS3蛋白），但HDAC11包含有對去乙酰化功能具有潛在重要作用的所有9部分保守序列，HDAC11與HDACs家族的其他成員共同揭示了一個假定的催化核序列，此序列可能包括了幾乎所有在真核生物HDACs與原核生物HDAC-相似蛋白中存在的活性不變催化序列。

總之，隨著結構生物學與計算機輔助藥物設計等學科的發展，以HDACs為靶點開發具有抗腫瘤活性的新型HDACs抑制劑必將具有廣闊的前景。