銀杏葉提取物對慢性低O₂高CO₂大鼠空間學習記憶的影響

陳松芳等

[摘要] 目的 探討銀杏葉提取物對慢性低O2高CO2大鼠空間學習記憶的變化及影響。 方法 建立慢性低O2高CO2大鼠肺動脈高壓模型。將SD大鼠72只，隨機分為正常對照組（NC組）、慢性低O2高CO2 4周組（4HH組）、慢性低O2高CO2 4周組+EGb高劑量（100 mg/kg）組[4HH+EGb（H）組]、慢性低O2高CO2 4周組+EGb低劑量（50 mg/kg）組[4HH+EGb（L）組]；大鼠空間學習記憶檢測，采用經典Morris水迷宮結合跳臺作業。 結果 4HH組大鼠學習與記憶能力下降明顯，表現為游泳逃避潛伏期及游泳總距離延長，跳臺作業錯誤次數明顯增加；銀杏葉提取物不同劑量干預組[4HH+EGb（H）組、4HH+EGb（L）組]逃避潛伏期及游泳總距離縮短，跳臺錯誤次數減少。 結論 銀杏葉提取物對慢性低O2高CO2大鼠空間學習記憶下降有改善或提高作用。

[關鍵詞] 慢性低O2高CO2；銀杏葉提取物；行為學；Morris水迷宮

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）15-0001-03

[Abstract] Objective To observe changes of spatial learning-memory in rats with chronic hypoxic hypercapnia and the effect of gingkgo biloba extra. Methods After established the rat model of chronic hypoxic hypercapnia，seventy-two rats were randomly divided into four groups： normal control （NC），hypoxic-hypercapnia 4-week （4HH），hypoxic-hypercapnia 4-week+gingkgo biloba extra （EGb） high dose （100 mg/kg） group[4HH+EGb（H）] and hypoxic-hypercapnia 4-week+EGb low dose （50 mg/kg） group[4HH+EGb（L）]. Praxiology in rats was asessed by the Morris water maze and step down test. Results The spatial learning-memory in rats exposed to chronic hypoxic-hypercapnia 4-week（4HH group）were displayed significant impairment in their performance，the longer mean escape latencies and swim path distances，the more error times. 4HH+EGb（H） and 4HH+EGb（L）groups shortened the reaction time of leaning， prolonged the latent time of memory， reduced times of mistakes. Conclusions EGb can enhance the capacity of learning-memory in the rats exposed chronic hypoxic hypercapnia.

[Key words] Chronic hypoxic hypercapnia； Gingkgo biloba extra； Praxiology； Morris water maze

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一類常見病和多發病，存在著很高的發病率和死亡率。近來許多研究相繼報道了COPD 引起的認知損害，而且該類損害并非只是巧合或抑郁引起[1]。由于慢性低O2高CO2模型很好地模擬了COPD的病理生理學改變，使之成為研究肺動脈高壓的發病機制和臨床防治的理想工具，然而眾多研究僅關注肺動脈高壓的發生發展機制上，而對認知行為功能影響的關注較少。銀杏（ginkgo biloba）為銀杏科銀杏屬植物，其主要有效成分為黃酮類和萜內脂類，具有擴張血管、保護機體組織和抗氧化等作用，從而臨床有用于缺血性腦血管病的治療[2，3]。而其對COPD認知功能的影響未見報道。因此本研究擬通過建立慢性低O2高CO2肺動脈高壓模型及銀杏葉提取物（gingkgo biloba extra，EGb）干預后，觀察動物行為學的改變。為臨床銀杏葉提取物對認知功能的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

常壓慢性低O2高CO2實驗模擬艙（濰坊華信氧業有限公司）、M192519便攜式O2和CO2氣體測定儀（上海牧晨電子技術有限公司）、大鼠跳臺儀、Morris 水迷宮（上海贊德醫療有限公司）、Medlab生物信號采集處理系統（南京美易科技有限公司）。

1.2 動物分組及模型制備

將72只SPF級雄性SD大鼠，體重180～220 g（由溫州醫科大學動物實驗中心提供，wydy 2012-0079），根據隨機數字表，分為四組：正常對照組（常壓常氧組/NC組），低O2高CO2 4周組（4HH組），低O2高CO2 4周組+EGb低劑量（50 mg/kg）組[4HH+EGb（L）組]、低O2高CO2 4周組+EGb高劑量（100 mg/kg）組[4HH+EGb（H）組]，每組隨機抽取8只。參考文獻[1]的方法，將后三組大鼠置于常壓低O2高CO2艙內，艙內O2濃度使其降低并維持在9%～11%（根據便攜式 O2和CO2氣體測定儀結果，通過N2調節），CO2濃度為6%～7%，進艙時間為每天早上8：00～16：00，每周6 d。動物飼養到規定時間后， 用戊巴比妥鈉（35 mg/kg BW）腹腔麻醉，右心導管法測定平均肺動脈（mPAP）、平均頸動脈壓（mCAP）。銀杏葉片（商品名：舒血寧片）：每片含銀杏葉提取物50 mg（廣西半宙制藥股份有限公司生產，國藥準字Z20064166）。模型+銀杏葉提取物組每天進艙前30 min灌服銀杏葉混懸液，對照組、模型組均按灌服等量0.9%生理鹽水。

1.3 行為學檢測

1.3.1 Morris水迷宮 Morris水迷宮由圓形水池、圓柱形平臺、攝像頭記錄及軟件分析系統4部分組合而成。圓形水池是一個直徑170 cm、高40 cm 的鐵皮圓桶，池壁內側用白色泡沫紙粘貼。水池分成4個象限，水溫（25±1）℃，將站臺固定置于第2象限中央，浸沒于水下2 cm，撒入適量墨汁水變為不透明狀，用以隱蔽水中的平臺。池壁上懸掛兩個以上物體作為近距離視覺參照物，并在水池外房間內有多種遠距離視覺參照物。實驗共進行5 d，每天上下午固定時間段兩次訓練。大鼠按順序從4個等分象限的中點面向池壁放入池中，記錄大鼠水中活動軌跡（攝像頭）并計算其爬上平臺時間，期間如超過120 s未找到平臺，終止該象限檢測，潛伏期記錄為120 s。待大鼠平臺上休息30 s再行下一象限檢測。用平均逃避潛伏期（mean escape latency）和游泳總距離（swim path distance）兩個參數反映大鼠的空間學習記憶成績。

1.3.2 跳臺試驗 實驗裝置主要由回避反應箱（30 cm×30 cm×30 cm）及一圓形跳臺組成。其中箱底為銅柵，可通刺激電流（0.5～0.6 mA）。圓形跳臺可隨機置于銅柵上，大鼠可在跳臺上停留以回避電擊。在實驗前為消除大鼠探究反應，需先將其放置于箱內，適應3 min。在訓練實驗期間，多數動物受電擊后，可能再次或多次跳至銅柵上，而后又重新跳回平臺。每次訓練5 min，記錄大鼠訓練時跳下臺受電擊次數，即第一次錯誤（EN1），作為訓練成績。24 h后以此作為記憶保持實驗，記錄每只動物3 min內跳下平臺的錯誤次數，即第二次錯誤次數（EN2），并且第一次跳下平臺的潛伏期（ST）。

1.4統計學處理

應用SPSS18.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）形成表示，經正態性檢驗后，多組樣本均數比較采用單因素方差分析（F 檢驗），均數兩兩比較采用 LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各大鼠mPAP、mCAP的變化

與NC組比較，4HH組及不同劑量EGb干預組mPAP有顯著性差異（P均<0.01），而mCAP無顯著性差異（P>0.05），見表1。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮成績

與NC對照組比較，4HH組平均逃避潛伏期延長和游泳總距離增加。EGb干預組（高劑量、低劑量）平均逃避潛伏期和游泳總距離均縮短，與4HH組比較，有顯著性差異（P<0.05），見表2。

2.3各組大鼠跳臺試驗結果

與NC組比較，4HH組潛伏期明顯縮短，EN1及EN2錯誤次數明顯增加（P<0.01）。EGb高劑量干預組與4HH組相比，潛伏期延長，EN1及EN2錯誤次數減少，均有顯著性差異（P<0.01）。見表3。

3 討論

銀杏（ginkgo biloba）為銀杏科銀杏屬植物，其主要有效成分為黃酮類和萜內脂類。根據現代的藥理學分析研究，EGb具有廣泛的生物藥理效應，如拮抗血小板凝聚、保護血管內膜、抑制微血栓形成、清除自由基等作用[2-4]。近年來的臨床療效觀察也發現EGb可明顯改善血管性癡呆患者的智能障礙，并認為該作用可能通過促進海馬NR1受體蛋白及mRNA表達，而抑制興奮性氨基酸的釋放及鈣超載，促進血管性癡呆大鼠海馬組織鈣調素、鈣調素激酶Ⅱ表達的作用相關[5、6]。此外，也有進一步的相關研究提示，EGb能加速神經沖動的傳導，對突觸的傳遞產生易化作用，對信息加工、記憶的鞏固和再現密切相關[7，8]。而EGb對于慢性低O2高CO2導致認知功能障礙的干預作用，未見報道。

近年來許多研究相繼報道了COPD 引起的認知損害，而且該類損害并非只是巧合或抑郁引起[9]。尸檢和動物學實驗對存在這類認知障礙的患者或動物的海馬區研究中發現了不同程度的損傷[10]。相對于國外單純低O2性肺動脈高壓動物模型，慢性低氧高二氧化碳模型很好地模擬了COPD 的病理改變[11]。本研究結果也表明，各模型組大鼠與正常對照組相比，mPAP明顯升高，而mCAP無顯著性差異，說明慢性低氧高二氧化碳肺動脈高壓模型已復制成功，且動物的體循環壓無明顯變化，提示模型組動物腦血流未受明顯影響。

在現代學習記憶研究中，Morris水迷宮往往被認為是非自我為中心的、空間參照的學習記憶研究可靠的理想的經典測試工具[12]，但是由于動物在水中的本能逃生反應，且在游泳中消耗能量較大，從而影響學習記憶的檢測。故此，本研究為了試驗結果更穩定可靠，同時結合跳臺作業實驗。后者優點在于可較準確地反映動物空間的辨別性學習記憶能力， 簡便易行，根據試驗設備的不同，一次可同時試驗多只動物，可實現組間平行操作。在該實驗中同時采用了跳臺潛伏期、錯誤次數等指標，排除了藥物非特異性干擾，從而使實驗結果更具說服性。從實驗結果看，兩個測試工具實驗的結果相平行。模型組大鼠學習與記憶能力均下降，而EGb干預（高、低劑量組）后大鼠的學習記憶能力，有不同程度的提高，表現為平均逃避潛伏期和游泳總距離縮短、EN1及EN2錯誤次數減少。同時我們在兩個劑量組間，未發現EGb在（50～100）mg/kg劑量區間，呈現干預作用有統計學意義。提示后續的該藥物量效研究上劑量區間可能需進一步擴大。

當然，動物在該造模環境下也可能出現一些生理變化，如：睡眠結構的紊亂、體重、腦血流的變化，從而影響空間學習記憶能力等[13，14]。在本研究中，我們根據各組體重的改變及造模動物的mCAP的檢測，可以排除體重及腦血流改變的影響。因實驗技術條件約束，在本研究中未能采用視頻監測，直觀地觀察實驗因素：慢性低O2高CO2，對大鼠睡眠結構的影響。然而有研究[15]認為，慢性低O2對動物睡眠沒有長期的影響，其在單純間斷低O2條件下，該研究通過皮層埋植的腦電圖（EEG）監測動物的睡眠結構，發現慢性低氧環境下，第一天大鼠睡眠結構明顯紊亂，總睡眠時間顯著減少，其中以非快動眼睡眠相（NREM）縮短更加明顯。但單純間斷低O2環境下第二日開始，大鼠的睡眠時間逐漸恢復，非快動眼睡眠相（NREM）和快動眼睡眠相（REM）逐步延長，第3～4天恢復到正常。

綜上所述，說明實驗動物在該造模環境下的一些生理反應是穩定的或變化甚微，也提示其不是導致模型組學習記憶能力下降主要因素。

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（收稿日期：2015-01-26）