死亡受體DR4基因多態性與潰瘍性結腸炎易感性的關系

藍德云等

[摘要] 目的 探討死亡受體（DR）4基因多態性與潰瘍性結腸炎（UC）易感性及其臨床病理特征的關系。 方法 在147例UC患者和244名健康對照者中，采用直接測序法檢測DR4（rs20575）基因單核苷酸多態性。采用非條件Logistic回歸分析DR4（rs20575）基因多態性與UC的關系。 結果 與對照組比較，UC組DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率明顯升高（5.78% vs 1.23%，P=0.001，OR=4.930，95%CI：1.192～12.651；7.48% vs 2.46%，P=0.025，OR=3.208，95%CI：1.161～8.869）。根據改良的Truelove & Witts嚴重程度分型標準將UC患者分為輕度、中度和重度。結果顯示中重度UC患者中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率顯著高于輕度患者（10.64% vs 3.50%，P=0.020，OR=3.282，95%CI：1.208～8.916；14.89% vs 4.00%，P=0.028，OR=4.200，95%CI：1.165～15.146）。DR4（rs20575）的突變等位基因和基因型頻率在廣泛性結腸炎和遠端結腸炎之間均無統計學差異（P>0.05）。 結論 DR4（rs20575）基因多態性與UC易感性密切相關，且可能影響UC的病情嚴重程度。

[關鍵詞] 死亡受體；基因多態性；潰瘍性結腸炎

[中圖分類號] R574 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）15-0004-04

[Abstract] Objective To explore the association between death receptor （DR） 4 gene polymorphism and the predisposition of ulcerative colitis （UC）. Methods DR4（rs20575） genotypes were determined by direct sequencing in a total of 147 UC patients and 244 healthy controls. Logistic regression analysis was employed to assess the relationship between DR4（rs20575）gene polymorphism and UC. Results Compared to the controls， the frequencies of variant allele（G）and genotype（CG+GG） of DR4（rs20575）were significantly increased in UC patients（5.78% vs 1.23%，P=0.001，OR=4.930，95%CI：1.192-12.651；7.48% vs 2.46%，P=0.025，OR=3.208，95%CI：1.161-8.869）. According to the Truelove & Witt Activity Index， the severity of UC was further stratified into the mild， moderate and severe disease. In result， variant allele （G）and genotype（CG+GG）in DR4（rs20575）were significantly higher in patients with moderate and severe UC than those with mild UC（10.64% vs 3.50%，P=0.020，OR=3.282，95%CI：1.208-8.916； 14.89% vs 4.00%，P=0.028，OR=4.200，95%CI：1.165-15.146）. DR4（rs20575） mutant allele and genotype frequencies between extensive colitis and distal colitis were no statistical difference （P>0.05）. Conclusion The genetic polymorphism of DR4（rs20575） is significantly related with the susceptibility to UC， as well as severity of the disease in this cohort of Chinese patients.

[Key words] Death receptor； Gene polymorphism； Ulcerative colitis

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC）是一種病因不明的直腸和結腸慢性非特異性的炎癥性疾病，病變只局限于大腸黏膜和黏膜下層。臨床主要表現為黏液膿血便、腹痛、腹瀉、里急后重、體重減輕和貧血等。據流行病學研究報道，我國UC的發病率約為11.6/100000，并呈逐年上升趨勢[1]。目前認為腸上皮細胞及免疫細胞的凋亡缺陷可能是引起腸組織中異常免疫應答、導致炎癥反應失控的關鍵環節[2]。

死亡受體（death receptor，DR）4是腫瘤壞死因子（TNF）相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL）的功能性受體之一，它與TRAIL結合后，能產生促靶細胞凋亡信號，不僅參與機體的免疫調節、免疫監視，還在多種自身免疫性疾病中發揮重要作用?，F有研究證實DR4/TRAIL凋亡信號能影響多種疾病的發生和發展，尤其是腫瘤和自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡[3]、多發性硬化[4]、類風濕性關節炎[5]等。據報道DR4介導的生物學功能除受自身蛋白功能和表達的影響外，還與其遺傳多態性密切相關。DR4基因位于染色體8p21-22，該區域存在多個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點，其中DR4（rs20575）是亞洲人群中常見的功能性位點[6-10]。至今國內外有關DR4基因多態性與UC的研究報道少見，因此本研究將在中國漢族人群中探討DR4（rs20575）基因多態性與UC的關系，旨在為深入闡明UC的遺傳免疫學發病機制提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2004年10月～2014年5月我院收集的住院或門診確診的UC患者147例，其中男75例，女72例，平均年齡（40.06±13.84）歲。根據2012年中華醫學會發表的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》，經過組織病理學、臨床表現、實驗室檢查、電子結腸鏡、影像學檢查等綜合確立UC診斷。根據蒙特利爾分類標準將UC患者分為廣泛結腸炎和遠端結腸炎。采用Truelove&Witts分型標準將UC患者分為輕度、中度和重度。對照組均來自泰順縣人民醫院體檢中心收集的健康體檢者，共244例，其中男130例，女114例，平均年齡（41.12±14.76）歲。所有研究對象在納入實驗前均經各項臨床檢查排除腫瘤、感染性疾病及系統性紅斑狼瘡、多發性硬化、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病。所有研究對象均為無血緣關系的漢族人群，納入實驗前均簽署知情同意書。本研究取得本院倫理委員會的批準。

1.2研究方法

1.2.1全基因組DNA提取 所有研究的對象均抽取空腹外周靜脈血約5 mL，置于乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）抗凝管中，采用Promega公司生產的試劑盒提取全血基因組DNA，后者稀釋至10 ng/μL后置于-20℃凍存。

1.2.2直接測序法檢測DR4（rs20575）基因多態性 ①引物設計：DR4（rs20575）的引物由Primer 6.0軟件設計，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。其引物序列如下：（F：5GGGCTGATAGATACGGGTACAAGGA3；R：5ACCACGACCAGGAACACAGCAT3），②PCR擴增及純化：PCR總反應體系10 μL，包括1 μL全基因組DNA，0.5U FastTaq酶（Roche公司），1 μL dNTP （Promega公司），1 μL的10×PCR緩沖液及適量無核酸酶去離子水。循環條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。取2 μL PCR產物，加入1.5U蝦堿性磷酸酶（SAP）和2U外切酶（Exon I），擴容至7.4 μL，置于37℃ 80 min，85℃ 15 min，4℃保存。③測序反應以及上機、純化：測序反應總體系6 μL，包括3 μL PCR純化產物，0.4 μL Bigdye （ABI公司），1.2 μL 5×buffer緩沖液，0.4 μL正向引物（10 μmol/L）和適量去離子水。循環條件：96℃ 1 min，96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 4 min，共25個循環。反應產物中加入醋酸鈉和無水乙醇混合物并離心，最后往96孔板中每孔中加入8 μL HiDi（甲酰胺，ABI公司），經ABI 3730遺傳分析儀平臺進行測序分析，獲取數據后經GeneMapper 4.0軟件（ABI公司）分析判讀基因型。

1.3統計學處理

所有數據均輸入SPSS18.0統計學軟件包處理。分別用χ2檢驗和兩獨立樣本的t檢驗比較組間性別、年齡差異。DR4基因型和等位基因的分布用頻數（率）來表示，其中等位基因頻數=純合子基因頻數×2+雜合基因頻數。采用χ2分析檢驗DR4基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡檢驗。經校正年齡、性別后，采用非條件Logistic回歸分析比較DR4（rs20575）基因多態性與UC易感性及臨床病理特征的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 一般資料

147例UC患者中，采用蒙特利爾分類，直腸、左半結腸炎（E1+E2）和廣泛結腸炎（E3）分別為82例（55.78%）和65例（44.22%）；以改良的Truelove & Witts嚴重程度分型標準[12]為依據，輕度100例（68.03%），中度31例（21.09%），重度16例（10.88%）；吸煙者57例（38.78%），不吸煙及已戒煙者90例（61.22%）。治療上采用柳氮磺吡啶或5-氨基水楊酸117例（79.59%），潑尼松51例（34.69%），抗生素36例（24.49%），免疫抑制劑2例（1.36%）。UC組與對照組在年齡、性別構成比方面差異無統計學意義（P均>0.05）。

2.2 DR4基因多態性在UC組和對照組之間的分布

對照組中經χ2檢驗發現DR4（rs20575）的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡規律（P>0.05）。在此基礎上，進一步研究發現：與對照組比較，UC組DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率均明顯升高（5.78% vs 1.23%，P=0.001，OR=4.930， 95%CI：1.192～12.651；7.48% vs 2.46%，P=0.025，OR=3.208，95%CI：1.161～8.869），而DR5（rs1047266）的突變等位基因和基因型頻率在UC組與對照組之間均無統計學差異（P均>0.05），見表1。

2.3 DR4基因多態性與UC疾病嚴重程度和病變范圍的關系

根據Truelove&Witts分型標準將UC分為輕度和中重度，結果顯示DR4（rs20575）基因多態性與UC患者的病情嚴重程度密切相關。中重度UC患者中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率明顯高于輕度患者（10.64% vs 3.50%，P=0.020，OR=3.282，95%CI：1.208～8.916；14.89% vs 4.00%，P=0.028， OR=4.200，95%CI：1.165～15.146）（表2）。而DR4（rs20575）基因多態性與UC患者的疾病部位無統計學關聯（P均>0.05），見表3。

3討論

TRAIL受體家族包括2種死亡受體DR4、DR5， 2種誘騙受體DcR1、DcR2及護骨素（osteoprotegerin，OPG）。理論上，DR4含有功能性死亡結構域，細胞表面的DR4與游離TRAIL發生結合后，將激活細胞內FADD和Caspase級聯反應，最終誘導靶細胞凋亡。而誘騙受體不含功能性死亡結構，與TRAIL結合后不產生凋亡信號，卻能競爭性削弱TRAIL誘導的細胞凋亡效應[11]。研究證實TRAIL介導的凋亡信號除受多種細胞因子和微生物因素影響外，還與其受體的遺傳多態性密切相關，尤其是死亡受體。

DR4基因全長33 kb，含10個外顯子，其中（rs20575）位于外顯子4，負責編碼的氨基酸位于細胞外富含半胱氨酸的區域，是DR4與TRAIL特異性結合的部位。研究證實若該位點野生型等位基因C突變為G，所編碼的蘇氨酸轉變為精氨酸，可能使受體-配體結合部位發生空間結構的改變，導致DR4與TRAIL結合缺陷，從而可能影響TRAIL凋亡途徑的正常啟動[12]。鑒于DR4/TRAIL介導的凋亡信號參與多種腫瘤及自身免疫性疾病的發病機制，DR4基因多態性可能與疾病易感性密切相關。例如，來自高加索人群的研究報道，DR4（rs20575）基因突變會增加頭頸部鱗癌發生的危險性[13]，但卻能降低套細胞淋巴瘤[14]和膀胱癌[15]的發病風險。但另有一項Meta分析結果顯示DR4（rs20575）基因多態性對卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的易感性無顯著影響[16]。此外，DR4（rs20575）基因多態性被證實與日本人群胃癌的易感性無統計學關聯[10]。推測上述結論差異的原因可能是由于不同種族人群間的遺傳背景差異所致。

本研究中，雖然DR4（rs20575）的突變等位基因G的頻率（1.23%）在對照組中偏低（表1），但與數據庫中千人基因組計劃所報道的中國人群最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）基本相符（北方漢族MAF：2.58%，南方漢族MAF：2.50%）。參考國內外現有的研究報道，發現DR4（rs20575）基因多態性存在明顯的種族差異，高加索人群中該位點的突變率較高[13，14]，而亞洲人群中則較低[10]。此外，本研究還發現與對照組相比較，UC組中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率明顯升高。中重度UC患者中DR4（rs20575）突變等位基因（G）和基因型（CG+GG）的頻率顯著亦顯著高于輕度患者。我們的研究結果提示DR4基因多態性可能與中國漢族人群UC密切相關，DR4基因突變不僅能影響UC易感性，還與UC疾病嚴重度密切相關。推測其機制可能是DR4基因突變后導致DR4功能或活性異常，直接或間接影響DR4信號的促細胞凋亡作用。近年來，已有研究證實TRAIL/DR4的凋亡信號參與體內先天和后天免疫功能調節，但該信號通路異常導致UC發病機制的潛在影響仍不清楚。研究發現TRAIL/DR4既能影響Th1/Th2細胞極化[17]，還與Treg細胞的分化密切相關[18]。TRAIL與其受體結合后通過NF-кB途徑調節炎性細胞因子的釋放[19]，而NF-кB是影響T細胞分化的關鍵因素，提示TRAIL在幼稚CD4+T細胞向Treg細胞分化過程中具有重要功能[20，21]。另據報道，Th17細胞對包括TRAIL在內的TNF家族成員所誘導的凋亡反應幾乎均存在抵抗。

總之，本研究提示DR4（rs20575）基因多態性與UC易感性密切相關，并且還可能影響UC的病情嚴重程度。由于DR4信號通路的影響因素紛繁復雜，涉及DR4蛋白的表達和功能及其配體TRAIL功能的影響，并且至今有關該通路對機體免疫系統的潛在影響仍未完全闡明，因此本研究尚不能完全詮釋該信號影響UC發病的潛在機制，這將是我們后續研究亟待解決的問題。

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（收稿日期：2015-03-26）