微囊化胰島素產生細胞的胰島素釋放情況觀察

王雅光　田鶴　穆長征

[摘要] 目的 微囊化后胰島素產生細胞（IPCs）的分泌能力的觀察。 方法 分離培養小鼠骨髓間充質干細胞（BM-MSCs）并傳代純化，應用大鼠胰腺損傷提取物（RPE）進行誘導分化，誘導后的細胞隨機分成微囊化組和未微囊化組；分別在1、2、3、5、10、15、20、25、30天對微囊化組、未微囊組及BMMSCs組進行胰島素釋放的檢測。 結果 1、2、3、5天微囊化組和未微囊化組都有胰島素釋放并呈上升趨勢，兩組之間沒有明顯差異；10 d以后未微囊化組胰島素釋放量有下降的趨勢，而微囊化組在第20天胰島素的釋放量開始下降，BM-MSCs組沒有胰島素的釋放。 結論 微囊不會影響細胞的存活，并且能夠延長細胞的存活時間和增加細胞的分泌能力。

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞；胰島素產生細胞；微囊化

[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）15-0008-03

[Abstract] Objective To study the effects of micro-capsule on the secretion capacity of insulin-producing cells（IPCs）. Methods Stem cells from originate mouse bone marrow mesenchymal were isolated，induced and purified. Rat pancreatic extract（RPE） was extracted from pancreases of rats. BMMSCs were induced by rat pancreatic extract. The induced cells were randomly divided into micro-encapsulated group and non-micro-encapsulated group. The experiment of glucose stimulation was performed to detect the level of insulin，respectively， at different time points（1， 2， 3， 5， 10， 15， 20， 25， 30 day）. Results The level of insulin secretion was increased after 1， 2， 3， 5 days of culture in micro-encapsulated IPCs and non-micro-encapsulated IPCs，but there were no significantly differences among the groups. The level of insulin secretion was declined in non-microencapsulated IPCs at 10 day，while there was no decreased in micro-encapsulated IPCs until 20 days. Conclusion The micro-capsule can promote the effect duration of IPCs，which supports the function of IPCs.

[Key words] Bone marrow mesenchymal stem cells（BMMSCs）；Insulin-producing cells（IPCs）；Micro-capsule

近年來糖尿病是影響人們健康的疾病之一，根據有關數據統計1型糖尿病患者約占10%。雖然可以使用外源性胰島素來進行治療，但血糖還是不能被控制到理想水平。近年隨著干細胞技術的不斷發展，為糖尿病的治療開辟了一條新的途徑。研究發現RPE能成功地將小鼠BMMSCs誘導為IPCs[1]，誘導后的細胞毒性反應比較低，并且這種誘導方法的效率也比較高。前期的實驗中本課題組也已經成功利用RPE將BMMSCs誘導成IPCs[2]。但是由于受到各種因素的影響，使IPCs的分泌時間不是很穩定；于是我們采用了新興的微囊技術，微囊具有的半通透性且囊內細胞的自由空間可以控制[3]；所以我們將在體外培養觀察微囊包裹的IPCs的胰島素分泌時間及分泌量的變化。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

于2009年3月～2011年3月期間由遼寧醫學院實驗動物中心提供的5 w齡SD大鼠（雌雄均可），由中國醫科大學實驗動物中心提供的SPF級4～8 w齡的昆明小鼠[雌雄均可，生產許可SCXK（遼）2008-0005]。IMDM培養基購自Hyclone公司，胰蛋白酶購自Amresco公司，胎牛血清購于Jibco公司，海藻酸鈉購自Sigma公司，多聚賴氨酸購自Biosharp公司，胰島素放射免疫試劑盒購自上海晨易生物公司，兔抗小鼠胰島素抗體購自北京博爾西科技公司。

1.2大鼠胰腺損失提取物的制備

取SD大鼠（5 w齡），用10%水合氯醛腹腔麻醉，切除2/3的胰腺，待48 h后處死大鼠并取出損傷的胰腺，PBS沖洗、剪碎、速凍之后加PBS在4℃高速離心以后取上清，BCA法分析上清液的蛋白含量，將檢測之后的上清液凍存、備用。

1.3 骨髓間充質干細胞的培養、誘導分化及鑒定

1.3.1 骨髓間充質干細胞的培養 昆明小鼠脫頸處死以后，在無菌狀態用1 mL IMDM培養基（培養基中含15% FBS、12 μM的L-谷氨酰胺、1%抗生素）沖出股骨和脛骨骨髓腔中的骨髓。離心后接種到25 cm2培養瓶內（細胞密度為1×106/mL），放于37℃、5%CO2培養箱中培養。待90%的細胞融合后，進行傳代純化，此時的細胞記作P1，做誘導分化實驗取P3細胞[4]。

1.3.2 誘導分化及鑒定 取出培養傳代后的骨髓間充質干細胞加入50 mg/g的大鼠胰腺提取液，誘導分化1周后，一部分進行雙硫腙檢測，另一部分做細胞免疫熒光檢測；雙硫腙檢測在原培養瓶內，加入雙硫腙染色工作液（10 g/L），37℃，水浴10 min后，鏡檢[5]；免疫熒光檢測取分化后的細胞，離心、固定、PBS沖洗后，封閉1 h，加一抗（兔抗小鼠胰島素抗體），室溫孵育1 h，PBS沖洗，然后加二抗（FITC標記山羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1 h，鏡檢[6]。

1.4 微囊化IPCs的制備

將誘導以后的IPCs置于1.8%海藻酸鈉溶液中，同時調節注射泵（70 mL/h）、氣流的速度（5 L/min）、海藻酸鈉濃度及液面的高度。使用氣體微囊發生器，將含有IPCs的海藻酸鈉溶液噴入100 mmol/L CaCl2溶液中，形成鈣珠以后，用多聚賴氨酸包裹（濃度為0.05%），將其用生理鹽水沖洗過后，再放入海藻酸鈉溶液（濃度為0.14%）里，再經檸檬酸鈉處理以后就獲得了微囊化的IPCs，然后放入六孔板中培養箱培養。 1.5 微囊化IPCs、未微囊IPCs及BMMSCs胰島素分泌情況的檢測

分別取BMMSCs、微囊化IPCs和未微囊化的IPCs懸液各3 mL。根據前人提出的方法[7]，刺激細胞和微囊用25 mM的葡萄糖，檢測時間點分別是1、2、3、5、10、15、20、25、30天。在放免儀上測定各管沉淀的放射性計數（cpm）。經計算機數據處理以后，計算出樣品的含量。

1.6 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，不同時點比較采用F檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1骨髓間充質干細胞誘導分化的檢測結果

原代的BMMSCs形狀大不相同，經傳代純化后的BMMSCs形態比較規則均一，呈長梭形（a）；RPE誘導分化后的BMMSCs經雙硫腙檢測呈猩紅色（b），核不著色；提示細胞內含有鋅離子，有胰島素的合成；細胞免疫熒光顯示細胞內有胰島素表達，呈綠色熒光（c），見封三圖1。

2.2不同時間點三組細胞胰島素分泌結果的顯示

在25 mM葡萄糖的刺激下，微囊化的IPCs和未微囊化IPCs均隨著葡萄糖的刺激釋放胰島素，BMMSCs不分泌胰島素，15 d的未微囊化組胰島素釋放量開始減少，25 d微囊化組胰島素釋放量開始減少；從結果上看IPCs是具有分泌胰島素功能的，且微囊并不會影響胰島素的釋放，見表1。

3 討論

BMMSCs具有較強的多向分化功能以及自我更新的能力，屬于成體干細胞的一種[8-10]。RPE作為本實驗所選用的誘導劑，是因其優點較多，如成本很低、作用溫和，最主要的是胰島素分泌的量較大、細胞存活率也較高。從雙硫腙的染色和細胞免疫熒光結果來看，本實驗誘導出的IPCs與小鼠胰島細胞相比沒有差別[11]；微囊是一種半透膜，能夠使小分子物質自由出入，同時又能阻止大分子進入；不但能滿足細胞的生長需要且又不影響其功能，微囊有體積小、制作方法較簡單等優點，并且膜內細胞的自由空間可控制[12]；本實驗通過對微囊化組、未微囊化組及BMMSCs組細胞葡萄糖刺激檢測胰島素的分泌情況顯示，第1、2、3、5天微囊化組和未微囊化組胰島素的釋放量并沒有明顯差別，10 d未微囊化細胞組胰島素釋放量開始減少，15 d已明顯看出兩組之間的差別，未微囊化組胰島素的釋放量明顯小于微囊化組；25 d時微囊化組胰島素的釋放量也開始有所下降，30 d時兩組胰島素釋放量均已下降，但是微囊化組胰島素的量明顯高于未微囊化組。而不經過誘導分化的骨髓間充質干細胞始終是沒有胰島素釋放的。而其他兩組經檢測均有胰島素釋放，且隨著時間的延長微囊化組胰島素釋放會更長久一些。表明微囊不但可使細胞存活不影響胰島素釋放，且能延長其存活時間，增加其胰島素釋放量。說明微囊內部的三維立體空間給細胞提供一個良好的生長環境，可能由于微囊表面有很大張力，所以細胞不但能向微囊內部擴散，而且還可能會吸附在微囊表面，使其能夠明顯改善細胞的增殖和分泌的能力。

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（收稿日期：2015-03-19）