加味麻杏石甘湯對(duì)急性放射性肺炎大鼠Smad蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

徐 佳林勝友

·論 著·

加味麻杏石甘湯對(duì)急性放射性肺炎大鼠Smad蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

徐 佳1林勝友2

目的 明確加味麻杏石甘湯對(duì)大鼠急性放射性肺炎的干預(yù)作用，探討其作用機(jī)制。方法復(fù)制急性放射性肺炎SD大鼠模型，按高、中、低劑量組分別給予加味麻杏石甘湯灌胃，陰性對(duì)照組、模型組予生理鹽水灌胃，2mL/（220g·d），連續(xù)8周。各組分別于第2、4、8周隨機(jī)處死4只大鼠，取肺組織，采用Western Blot方法檢測(cè)大鼠肺組織P-Smad2、P-Smad3、Smad6、Smad7蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)照射后，模型組P-Smad2、P-Smad3表達(dá)上調(diào)（P均＜0.01），各用藥組較模型組有不同程度下降（P均＜0.01）；模型組Smad6、Smad7表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），各用藥組較模型組有不同程度上升（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 加味麻杏石甘湯能下調(diào)急性放射性肺炎模型大鼠肺組織P-Smad2、PSmad3蛋白表達(dá)，上調(diào)Smad6、Smad7蛋白表達(dá)。

大鼠；急性放射性肺炎；加味麻杏石甘湯；Smad蛋白

胸部腫瘤放療過(guò)程中，放射性肺炎發(fā)生率為5%～15%[1]，對(duì)肺功能有不同程度的影響。放射性肺損傷不僅限制放射治療的實(shí)施，也降低患者的放療效果和生存質(zhì)量，甚至影響患者生存期。目前，臨床多使用激素類(lèi)、抗生素、抗氧化劑等藥物治療放射性肺炎，但療效有限，且不良反應(yīng)大，不宜長(zhǎng)期使用。已有研究[2]證明，放射性肺損傷的發(fā)生和形成與TGF-β有密切關(guān)系，而Smad蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)過(guò)程中重要的細(xì)胞因子[3]。本研究擬通過(guò)建立急性放射性肺炎的動(dòng)物模型，觀察放療后大鼠肺組織PSmad2/3、Smad6/7的表達(dá)水平，明確加味麻杏石甘湯對(duì)急性放射性肺炎的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（220±20）g，上海西普爾-本凱試驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥品與試劑 以大鼠重220g每日灌胃量為2mL計(jì)算，相當(dāng)于正常人體的20倍劑量，將麻杏石甘湯（炙麻黃9g，苦杏仁12g，生石膏18g，生草6g，金銀花9g等）加水濃煎至3g/mL。主要試劑：兔抗大鼠p-Smad2抗體（#3108，美國(guó)CST公司）、兔抗大鼠p-Smad3抗體（#9520，美國(guó)CST公司）、兔抗大鼠Smad6抗體（ab124890，美國(guó)Abcam公司）、兔抗大鼠Smad7抗體（ab13727，美國(guó)Abcam公司）、小鼠抗大鼠GAPDH抗體（Mab5465，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）、近紅外燃料標(biāo)記的二抗（鼠抗、兔抗，美國(guó)Li-Cor公司）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型，P0010S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、PVDF膜（0803LK，聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀 器 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo scientific公司Varioskan Flash and skanIt software）、小型垂直蛋白電泳儀（552BR021109，美國(guó)BIO-RAD公司）、紅外激光雙色成像系統(tǒng)（Odyssey CLx Infrared Imaging System，美國(guó)Li-Cor公司）、超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性放射性肺炎大鼠模型建立[4]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字法取12只作為陰性對(duì)照組，不予處理。剩余48只大鼠，以如下方法進(jìn)行造模：大鼠在未麻醉狀態(tài)下，腹部朝上，排列整齊，盡量使大鼠的肺部均位于一直線上，6只大鼠一架。用模擬定位機(jī)校準(zhǔn)大鼠雙肺位置，用瑞士醫(yī)科達(dá)PreciseLINAC直線加速器（杭州市腫瘤醫(yī)院提供）進(jìn)行單次全胸照射大鼠雙肺，用鉛塊屏蔽保護(hù)大鼠其余部分。照距SSD為100cm，總劑量20Gy。

2.2 分組與給藥 模型成功建立后，根據(jù)給藥劑量不同按隨機(jī)數(shù)字法分為麻杏石甘湯高、中、低劑量組和模型組，每組12只。麻杏石甘湯高、中、低劑量組分別給予相當(dāng)生藥量為3、1.5、0.75g/mL的麻杏石甘湯灌胃（相當(dāng)于正常成人體20、10、5倍劑量），2mL/（220g·d），連續(xù)8周。模型組和陰性對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，2mL/（220g·d），連續(xù)8周。分別于第2、4、8周隨機(jī)各處死4只大鼠，取肺組織，保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。

2.3 Western Blot法檢測(cè)肺組織P-Smad2/3、Smad6/ 7蛋白的表達(dá) 取大鼠肺組織，BCA法提取總蛋白并計(jì)算蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后二抗室溫避光孵育。再次洗膜后將PVDF膜正面朝下置于紅外激光雙色成像系統(tǒng)，經(jīng)Odyssey V3.0系統(tǒng)掃膜，成像于電腦。應(yīng)用該軟件測(cè)量條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，灰度比=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組P-Smad2表達(dá)比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組大鼠各時(shí)間段P-Smad2蛋白均維持在一較低水平；經(jīng)照射后模型組大鼠P-Smad2蛋白較陰性對(duì)照組表達(dá)升高，在第2周達(dá)到高峰（P＜0.01），第8周模型組較陰性對(duì)照組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，各濃度麻杏石甘湯組第2周、第4周和第8周時(shí)均較模型組降低（P＜0.01），其中，麻杏石甘湯低劑量組第4周低于高、中劑量組（P＜0.01），第8周時(shí)低于高劑量組（P＜0.01），中劑量組第8周低于高劑量組（P＜0.01）。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 各組各時(shí)間段P-Smad2蛋白表達(dá)的變化

表1 各組各時(shí)間段P-Smad2灰度值比較（±s）

表1 各組各時(shí)間段P-Smad2灰度值比較（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

陰性對(duì)照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組33333 0.194±0.004 0.256±0.003##0.098±0.011** 0.106±0.007** 0.105±0.006** 0.037±0.003 0.052±0.003##0.034±0.003** 0.032±0.004** 0.017±0.002**△△▲▲0.038±0.002 0.041±0.003 0.021±0.003** 0.011±0.001**△△0.015±0.002**△△

3.2 各組P-Smad3表達(dá)比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組大鼠各時(shí)間段P-Smad3蛋白表達(dá)均維持在一較低水平；經(jīng)照射后模型組大鼠P-Smad3蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組升高，在第2周達(dá)到高峰（P＜0.01）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，高劑量組第2周、第8周低于模型組（P＜0.05），中、低劑量組各時(shí)間段均低于模型組（P＜0.01）；其中，中劑量組第2周、第4周、第8周均低于高劑量組（P＜0.01），第2周、第8周低于低劑量組（P＜0.05），高劑量組第2周低于低劑量組（P＜0.01），低劑量組第4周低于高、中劑量組（P＜0.01）。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各時(shí)間段各組P-Smad3蛋白的表達(dá)變化

表2 各組各時(shí)間段P-Smad3灰度值比較（±s）

表2 各組各時(shí)間段P-Smad3灰度值比較（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

陰性對(duì)照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組33333 0.506±0.006 1.253±0.005##0.666±0.005** 0.536±0.004**△△0.919±0.007**△△▲▲0.865±0.005 1.041±0.013##1.033±0.017 0.792±0.006**△△0.587±0.031**△△▲0.041±0.004 0.056±0.003##0.048±0.005* 0.038±0.002**△△0.046±0.004**▲

3.3 各組Smad6表達(dá)比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組大鼠各時(shí)間段Smad6均維持在一較高水平；經(jīng)照射后模型組大鼠Smad6表達(dá)較陰性對(duì)照組下降，在第8周達(dá)到高峰（P＞0.05），第4周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，高劑量組各時(shí)間段均較模型組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中劑量組第8周高于模型組（P＜0.05），低劑量組第8周高于模型組（P＜0.01）；高劑量組第2周高于中劑量組（P＜0.01），中劑量組第8周高于高劑量組（P＜0.01），低劑量組第8周高于高劑量組（P＜0.01），第2周、第8周高于中劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 各時(shí)間段各組Smad6蛋白的表達(dá)變化

表3 各組各時(shí)間段Smad6灰度值比較（±s）

表3 各組各時(shí)間段Smad6灰度值比較（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別陰性對(duì)照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組只數(shù)33333 2周1.677±0.194 1.613±0.247 1.677±0.23 1.052±0.303*△△1.712±0.097▲▲4周0.468±0.191 0.164±0.075##0.215±0.058 0.181±0.049 0.253±0.112 8周0.113±0.009 0.106±0.026 0.114±0.02 0.283±0.014**△△0.337±0.029**△△▲

3.4 各組Smad7表達(dá)比較 Western Blot結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組大鼠各時(shí)間段Smad7均維持在一較高水平；經(jīng)照射后模型組大鼠Smad7表達(dá)較陰性對(duì)照組下降，在第8周達(dá)到高峰，但各時(shí)間段差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，高劑量組第2周、第8周高于模型組（P＜0.01），中劑量組第2周、第8周高于模型組（P＜0.01），低劑量組第2周、第4周、第8周高于模型組（P＜0.05）；高劑量組第8周時(shí)高于低劑量組（P＜0.01），中劑量組第2周高于高劑量組、第8周高于低劑量組（P＜0.01），低劑量組第2周、第4周高于高劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表4。

圖4 各時(shí)間段各組Smad7蛋白表達(dá)

4 討 論

放射性肺炎是指肺組織因大劑量放射性照射而引起的肺部急性炎性反應(yīng)，是胸部腫瘤放療最常見(jiàn)的并發(fā)癥[5]，骨髓疾病中也可見(jiàn)。肺組織對(duì)放射性非常敏感，極易出現(xiàn)急性損傷，通常在放療開(kāi)始1～3個(gè)月后即出現(xiàn)，以發(fā)熱、干咳、痰中帶血、胸痛、憋悶等為主要臨床表現(xiàn)。

表4 各時(shí)間段各組Smad7灰度值比較（±s）

表4 各時(shí)間段各組Smad7灰度值比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別陰性對(duì)照組模型組高劑量組中劑量組低劑量組只數(shù)33333 2周4.586±0.287 3.674±0.626 5.565±1.170** 9.631±0.566**△△8.525±0.50**△△4周0.431±0.261 0.270±0.347 0.400±0.184 0.563±0.131 0.939±0.444**△8周0.107±0.003 0.038±0.004 0.108±0.014** 0.122±0.021** 0.063±0.004*△△▲▲

Smad蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)重要的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，而放射性肺炎的形成發(fā)展與細(xì)胞因子TGF-β1最為密切相關(guān)[6-7]。TGF-β通路通過(guò)其他細(xì)胞因子將信號(hào)傳遞至下游Smad蛋白[8]，從而影響細(xì)胞核內(nèi)的基因表達(dá)。Smad蛋白家族包括受體調(diào)節(jié)型smad蛋白（Smad2、Smad3、Smad5、Smad8）、抑制型smad蛋白（Smad6、Smad7）和通用調(diào)節(jié)型Smad蛋白（Smad4）。Smad2、Smad3和（或）Smad4過(guò)度表達(dá)以及Smad6、Smad7被抑制可使TGF-β1持續(xù)激活。

麻杏石甘湯出自《傷寒論》，由麻黃、杏仁、石膏、炙甘草四味藥組成。配伍嚴(yán)謹(jǐn)，清宣降三法具備，針對(duì)放射性肺炎急性期熱毒攻伐、痰瘀互結(jié)之證，共奏清熱解毒、宣肺平喘之效。多個(gè)臨床研究[9-11]采用麻杏石甘湯為主的方劑治療早期放射性肺炎，均取得較好地療效。

本實(shí)驗(yàn)采用20Gy全胸照射建立大鼠急性放射性肺損傷模型。課題組前期研究[12-13]已多次運(yùn)用單次全胸20Gy照射大鼠雙肺成功復(fù)制放射性肺炎模型，且用HE染色病理組織學(xué)觀察肺組織情況與文獻(xiàn)[14-16]相符。

Smad2/3的磷酸化激活是TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路激活的最重要一步及標(biāo)志，所以，P-smad2/3蛋白表達(dá)量即意味著TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路激活的程度[17]。本結(jié)果顯示，P-smad2/3經(jīng)照射后表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；加味麻杏石甘湯干預(yù)后，各加味麻杏石甘湯組p-smad2/3表達(dá)較模型組下調(diào)，其中加味麻杏石甘湯中劑量組起效時(shí)間較快，且效果持久。模型組Smad6/7表達(dá)較陰性對(duì)照組下降；經(jīng)加味麻杏石甘湯干預(yù)后，各加味麻杏石甘湯組Smad6/7表達(dá)均有所上調(diào)，其中中劑量組對(duì)Smad7的干預(yù)中起效快且效果持久。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，p-smad2/3、Smad6/7作為細(xì)胞因子參與放射性肺損傷的發(fā)生過(guò)程。加味麻杏石甘湯干預(yù)以后，各時(shí)間段P-smad2/3蛋白表達(dá)有所下降，Smad6/7蛋白表達(dá)有所升高，其中中劑量組起效快且藥效持久，且與模型組相比大鼠整體情況有改善，證實(shí)加味麻杏石甘湯治療急性放射性肺損傷有效，其機(jī)制可能與干預(yù)Smad蛋白的表達(dá)有關(guān)。但放射性肺損傷的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。加味麻杏石甘湯治療放射性肺損傷的機(jī)制除了TGF-β/Smad通路以外是否尚存在其他信號(hào)通路等都值得進(jìn)一步研究。

［1］Joussen AM，Gardner TW，Kirchhof B，et al.Retinal vascular diseases［J］.Berlin：Springer，2007：519-527.

［2］蔣雪超，郝俊芳.放射性肺損傷研究進(jìn)展［J］.中華腫瘤防治雜志，2010，17（22）：1888-1891.

［3］姜云志，沈以紅，代方銀.Smad介導(dǎo)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［J］.蠶學(xué)通訊，2008，28（3）：20-25.

［4］代琳，舒靜娜，林勝友.麻杏石甘湯對(duì)放射性肺炎急性期的干預(yù)作用［J］.河南中醫(yī)，2012，32（1）：40-42.

［5］吳曉阜，朱瑞霞.胸部腫瘤放療所致急性放射性肺炎的相關(guān)因素分析［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（10）：1963-1964.

［6］Anscher MS，Kong FM，Marks LB，et al.Changes in plasma transforming growth factor beta during radiotherapy and the risk of symptomatic radiation-induced pneumonitis［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1997，37（2）：253-267.

［7］Akihito Nishioka，Yasuhiro Ogawa，Tatsuo Mima，et al.Histopathologic amelioration of fibroproliferative change in rat irradiated lung using soluble transforming growth factorbeta（TGF-β）receptor mediated by adenoviral vector［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，58（4）：1235-1241.

［8］Yan XH，Pan J，Xiong WW，et al.Yin Yang 1（YY1）synergizes with Smad7 to inhibit TGF-βsignaling in the nucleus［J］.Science China，2014，57（）：128-136.

［9］王玨，李永強(qiáng)，張衛(wèi)平.加味麻杏石甘湯防治放射性肺損傷的臨床研究［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（5）：377-378.

［10］胡彥輝，于衛(wèi)江，崔慶麗.清肺養(yǎng)陰活血方預(yù)防放射性肺炎的臨床研究［J］.中藥藥理與臨床，2014，30（6）：175-177.

［11］劉來(lái)昱，丁鐵，李啟生.放射性肺損傷肺成纖維細(xì)胞的活化機(jī)制研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（5）：1082-1084.

［12］林勝友，孫曉楠，代琳.麻杏石甘湯對(duì)急性放射性肺炎大鼠IL-6與PDGF水平的影響［J］.浙江中醫(yī)雜志，2011，46（7）：517-519.

［13］陸金華，林勝友，代琳.麻杏石甘湯對(duì)放射性肺炎TGF-β、Smad7調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（7）：795-802.

［14］杜雪梅，柳曉蘭，崔玉芳，等.放射性肺損傷小鼠動(dòng)物模型的建立及其病變規(guī)律［J］.中國(guó)體視學(xué)與圖像分析，2003，8（4）：203-206.

［15］孫萬(wàn)良，張晶，魏麗，等.大鼠放射性肺損傷模型的建立與動(dòng)態(tài)觀察［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（26）：5001-5007.

［16］曹小飛，陳龍華，劉國(guó)龍.大鼠放射性肺損傷模型的動(dòng)態(tài)病理學(xué)觀察［J］.中華腫瘤防治雜志，2010，17（11）：818-822.

［17］Li JH.Smad7 inhibits fibrotic effect of TGF-beta on renal tubular epithelial cells by blocking smad2 activation［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13（6）：1464-1472.

（收稿：2015-06-06 修回：2015-08-13）

Intervention of Modified Maxing Shigan Decoction on Smad Protein Expression in Rats with Acute Radiation Pneumonitis

XU Jia1,LIN Shengyou2. 1 Department of Oncology,Xiaoshan First People's Hospital,Hangzhou (311200),China;2 Wushan Guoyiguan,Hangzhou Cancer Hospital,Hangzhou(311102),China

Objective To investigate the effect of modified Maxing Shigan decoction on rats with acute radiation pneumonitis and the underlying mechanism.Methods SD rat models of acute radiation pneumonitis were established.Rats were divided into modified Maxing Shigan decoction groups（high dose,middle dose,low dose）,control group,and model group.Modified Maxing Shigan decoction groups were intragastrically given 3,1.5,and 0.75g/mL（2mL/220g·d）of the corresponding drug for 8 weeks.Model group and control group were given equivalent volume of normal saline for the same period of time.Every 4 rats in each group were randomly sacrificed at 2,4,and 8 weeks to obtain lung tissue.The expressions of P-Smad2,P-Smad3,Smad6,and Smad7 proteins in lung tissue were analyzed by Western-blotting.Results After radiation,the expressions of P-Smad2 and P-Smad3 proteins in model group were up-regulated（P＜0.01）,while those in modified Maxing Shigan decoction groups were all downregulated（P＜0.01）.The expressions of Smad6 and Smad7 proteins in model group were down-regulated（P＜0.01）, while those in modified Maxing Shigan decoction groups were up-regulated（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Modified Maxing Shigan decoction can down-regulated the expressions of P-Smad2 and P-Smad3 proteins and up-regulated the expression of Smad6 and Smad7 proteins in lung tissue of rats with acute radiation pneumonitis.

rats;acute radiation pneumonitis;modified Maxing Shigan decoction;Smad protein

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目（No.81174246）

1杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科（杭州 311200）；2杭州市腫瘤醫(yī)院吳山國(guó)醫(yī)館（杭州 310002）

林勝友，Tel：13505715111；E-mail：linsy0628@163.com