丹紅注射液對膿毒癥大鼠心肌組織氧自由基及HMGB1表達的影響

胡丹丹楊國良樓黎明

丹紅注射液對膿毒癥大鼠心肌組織氧自由基及HMGB1表達的影響

胡丹丹1楊國良2樓黎明1

目的 觀察丹紅注射液對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用，探討其可能作用機制。方法24只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、丹紅組，每組6只。盲腸結扎并穿孔（CLP）法建立膿毒癥大鼠動物模型，觀察各組心肌組織超微結構改變，心肌組織丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）和高遷移率族蛋白1（HMGB1）含量的變化。結果 CLP術后24h，與手術組比較，模型組、丹紅組大鼠心肌組織MDA含量［（5.5706±1.3251）μ/mg prot、（3.9900±1.0559）μ/mg prot比（1.1506±0.1771）μ/mg prot］、HMGB1蛋白表達量（0.6074±0.0504、0.5010±0.1049比0.1427± 0.0345）升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而模型組、丹紅組大鼠心肌組織SOD活力［（10.5276± 3.0568）nmol/mg prot、（15.5129±3.4425）nmol/mg prot比（20.5604±3.1312）nmol/mg prot］降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅組大鼠心肌組織MDA含量表達降低［（3.9900±1.0559）μ/ mg prot比（5.5706±1.3251）μ/mg prot，P＜0.05］，SOD活力升高［（15.5129±3.4425）nmol/mg prot比（10.5276±3.0568）nmol/mg prot，P＜0.05］，心肌組織HMGB1表達量降低（0.5010±0.1049比0.6074± 0.0504，P＜0.05）；相同時間點心肌超微結構提示模型組大鼠心肌細胞線粒體腫脹，部分空泡變性；丹紅組心肌細胞損傷輕于模型組。結論 丹紅注射液對膿毒癥大鼠心肌損傷有一定程度的保護作用，其作用機制可能與清除氧自由基，降低HMGB1含量有關。

大鼠；膿毒癥；心肌損傷；氧自由基；HMGB1；丹紅注射液

膿毒癥是嚴重創傷、感染、休克等多種應激狀態下的常見并發癥，發病率高，死亡率高，心功能不全和心肌細胞損傷是膿毒性休克的嚴重表現之一，約有40%～50%的膿毒癥患者會合并心臟功能不全。與膿毒癥患者相比，合并心肌功能障礙的膿毒癥患者的死亡率從20%升高到70%[1]。丹紅注射液主要成分丹參、紅花，功效活血化瘀，通脈舒絡。既往主要用于冠心病、瘀血型肺心病等治療，已證實其有改善微循環、抗氧自由基等作用，而對膿毒癥心肌損傷是否有保護作用尚未報道。本研究以大鼠盲腸結扎并穿孔（CLP）法復制膿毒癥動物模型，通過丹紅注射液對膿毒癥大鼠心肌組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、高遷移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）水平變化及對心肌組織超微結構的影響，評價丹紅注射液對膿毒癥大鼠心肌損傷的保護作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 雄性Wistar大鼠24只，清潔級，體質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供和飼養，許可證號：SYXK（浙）2013-0184。大鼠造模前在標準飼養條件下適應性喂養1周，術前24h機（Eppendorf Centrifuge 5804，德國）；紫外分光光度計（BECKMANDU-600，美國）；電泳轉膜裝置（BioRAD，美國）；TS-1型脫色搖床（江蘇省海門市麒麟醫用儀器廠）；數顯恒溫水浴鍋（泰州市華普達教學儀器有限公司）；BioSenSC300凝膠圖象分析系統（上海山富科學儀器有限公司）；等。

1.2 藥 物 丹紅注射液（規格：10mL/支，山東步長制藥有限公司生產）；戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司）。

1.3 主要試劑 SOD試劑盒、MDA試劑盒（批號20090603，南京建成生物工程研究所）；Bradford蛋白質定量試劑盒（批號PA102，天根生化科技有限公司）；山羊抗HMGB1多克隆抗體（Santa，美國）；山羊抗β-actin多克隆抗體（Santa，美國）；辣根酶標記兔抗山羊二抗（上海麥約爾生物技術有限公司）；等。

2 實驗方法

2.1 膿毒癥模型制備 盲腸結扎穿孔術（CLP）法制備膿毒癥模型：大鼠經2%戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，沿腹正中作一長1.5cm的切口，打開腹腔后小心分離盲腸，避免碰觸腸系膜血管，在盲腸根部結扎，在與腸系膜相對的盲端腸壁漿膜面用9號針頭穿刺2次，輕擠出少量內容物，還納盲腸于腹腔，關閉腹腔，逐層縫合，術后即刻予以皮下注射生理鹽水10mL/kg補充手術過程中丟失的體液。

2.2 分組及給藥 24只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和丹紅組，每組6只。正常組與其余各組同步飼養，麻醉后腹主動脈采血處死；假手術組麻醉后開腹翻動腸道，關腹，24h后麻醉，腹主動脈采血處死；模型組和丹紅組行CLP，術后分別于術后0、6、12h尾靜脈注射生理鹽水5mL/kg或丹紅注射液5mL/kg，于CLP術后24h麻醉并腹主動脈采血處死。

2.3 指標檢測

2.3.1 心肌組織透射電鏡樣品制備及觀察 迅速切取1mm3大小的心肌組織放入2.5%戊二醛固定液固定，電鏡標本制備由上海中醫藥大學病理教研室完成，透射電子顯微鏡下觀察心肌組織超微結構。

2.3.2 心肌組織勻漿蛋白含量測定 Bradford蛋白質定量試劑盒測定，嚴格按說明書操作。

2.3.3 心肌組織MDA含量測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定，嚴格按試劑盒按說明書操作。

2.3.4 心肌組織SOD含量測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.3.5 心肌組織HMGB1蛋白含量檢測 采用免疫印跡（Western Blot）法測定。具體步驟為：蛋白抽提，Bradford法測定蛋白含量；配制SDS-PAGE凝膠，將樣品與2×SDS凝膠加樣緩沖液以1：1混勻，每孔配制含80μg總蛋白樣的樣品液；上樣前沸水煮10min，冰浴3min；將準備好的樣品液和生物素標記的預染蛋白質分子量標準分別上樣，預染蛋白質分子量標準加入第一個孔中；使用Bio-Rad電泳裝置，樣品首先在100V電壓下電泳至染料接近分離膠頂端；然后120V電壓電泳至溴酚藍剛出膠底部；依據膠的大小裁取膜和濾紙6片，放入Western轉膜液中平衡10min左右；裝配轉移三明治：海綿、3層濾紙膠膜3層濾紙海綿，每層放好后，用試管平壓趕去氣泡；將轉移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加入轉膜液，插上電極，220mA，1.5h，期間保持恒電流；轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜；參照預染蛋白質分子量標準，根據目的蛋白與內參β-Actin位置的不同，將膜切割成兩段并標記；用蒸餾水將膜漂洗干凈；配制3%BSA溶液，膜在3%BSA溶液中室溫搖床，封閉過夜；封閉后的膜用PBST洗膜3次，每次10min；加入一抗（目的蛋白抗體1：400，內參抗體1：2000），室溫搖床2h，抗原抗體結合；PBST洗膜3次，每次10min。加入HRP標記的二抗以結合一抗，室溫搖床1h；PBST洗膜3次，每次10min；化學發光試劑盒中兩種試劑等比例混合為反應液，將膜置于反應液中室溫孵育5min；去除過量的反應液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光；圖片掃描保存為電腦文件，用分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數字化；目的蛋白的灰度值除以內參β-Actin的灰度值以校正誤差，所得結果代表樣品的蛋白相對含量。

2.4 統計學方法 應用SPSS20.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（±s） 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組心肌組織超微結構變化 正常組及假手術組大鼠心肌細胞內肌絲、肌節結構清晰，排列整齊，線粒體排列整齊，肌原纖維結構正常（見圖1）。CLP術后24h，模型組大鼠心肌細胞線粒體腫脹，部分空泡變性，大部分心肌細胞出現自溶，偶見心肌細胞呈核固縮、胞漿崩解等壞死改變。丹紅組大鼠心肌細胞損傷程度輕于模型組（見圖1）。

圖1 各組心肌組織超微結構圖A正常組（×8200）；B假手術組（×16500）；C模型組術后24h（×16500）；D丹紅組術后24h（×16500）

3.2 各組心肌組織MDA及SOD含量變化 CLP術后24h，與正常組、假手術組比較，模型組和丹紅組大鼠心肌組織MDA含量明顯升高（P＜0.05），SOD活力顯著降低（P＜0.05）；丹紅組大鼠心肌組織MDA含量較模型組降低（P＜0.05），SOD活力較模型組升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌組織MDA和SOD含量比較（±s）

表1 各組大鼠心肌組織MDA和SOD含量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

正常組假手術組模型組丹紅組6666 1.0889±0.0195 1.1506±0.1771 5.5706±1.3251*△3.9900±1.0559*△▲21.1895±4.1127 20.5604±3.1312 10.5276±3.0568*△15.5129±3.4425*△▲

3.3 各組心肌組織HMGB1變化 CLP術后24h，與正常組、假手術組比較，模型組、丹紅組大鼠心肌組織HMGB1蛋白表達量明顯增加（P＜0.05）；丹紅組大鼠心肌組織HMGB1蛋白表達量較模型組降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織HMGB1表達量比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織HMGB1表達量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；HMGB1：高遷移率族蛋白1

正常組假手術組模型組丹紅組6666 0.1364±0.0377 0.1427±0.0345 0.6074±0.0504*△0.5010±0.1049*△▲

4 討 論

膿毒癥是臨床常見危急重癥，中醫無“膿毒癥”的病名，但從臨床表現來看，現多將其歸于“外感熱病”或“溫熱病”范疇，對其病機認識雖未統一，但絕大多數醫家對其病機認識為“正氣虧虛、溫毒內侵、瘀血內結”[2-3]，其中正氣虧虛是基礎病機，溫毒內蘊是主要病因，而瘀血內結在膿毒癥的發展過程中起重要作用。瘀血最常阻塞脈絡，而心主血脈，因此，膿毒癥心肌損傷是膿毒癥發展中重要的一環。我們的前期研究表明，活血化瘀法可降低膿毒癥大鼠的心肌損傷[4]。本研究以電鏡觀察膿毒癥大鼠心肌細胞超微結構，發現膿毒癥大鼠心肌線粒體腫脹，部分肌纖維稀疏；部分心肌細胞空泡變性，部分心肌細胞出現自溶，偶見心肌細胞呈核固縮、胞漿崩解等壞死改變。丹紅組心肌病變較模型組心肌損傷輕微，表明丹紅注射液具有減輕膿毒癥大鼠心肌損傷的作用。

膿毒癥心肌損傷的具體機制目前尚未完全明確，但大多認為與氧自由基損傷、炎癥失控等有關。氧自由基是心肌抑制的主要始動因子之一，可引起脂質過氧化蛋白氧化水解ATP耗竭DNA破壞催化花生四烯酸代謝，從而使心肌細胞功能受到抑制，降低心肌收縮力，減少心排血量，引起膿毒血癥時的心肌冬眠[5-6]。同時，氧自由基作為機體內一種活躍的小分子，參與了炎性介質的級聯放大細胞凋亡Ca2+通道及自身氧化平衡的調節，造成細胞膜流動性與Ca2+通透性增加，破壞了細胞膜結構完整性，導致鈣跨膜內流與鈣超載，最終導致心肌細胞損傷[7]。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的穩定代謝產物，可使DNA、RNA發生交聯，繼而出現斷裂和失活，其含量變化間接反映了氧自由基含量的變化。SOD是生物體內專一清除超氧陰離子的特異性抗氧化酶，能清除氧自由基，保護細胞免受損傷，SOD活力的高低能間接反映機體清除氧自由基的能力。本研究結果顯示，CLP術后24h，MDA含量顯著升高，而SOD活力則降低，表明膿毒癥時，機體產生大量氧自由基，體內清除氧自由基的能力降低，脂質氧化和抗氧化失平衡，與某些細胞因子的生成相互促進，形成惡性循環，促成膿毒癥及膿毒癥心肌損傷的發生發展。丹紅組MAD含量及SOD活性均較模型組有所改善，表明丹紅注射液可改善自由基代謝，清除氧自由基，保持脂質氧化和抗氧化處于平衡狀態，保護生物體免受自由基攻擊的作用，進而保護膿毒癥心肌損傷。

炎癥介質在膿毒癥的發生發展中起著決定性的作用，高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種高度保守的DNA結合蛋白，與核小體結構的修復及基因轉錄調控密切相關。HMGB1由壞死細胞或活化的單核/巨噬細胞被動或主動釋放至細胞外，并發揮促炎和修復作用。HMGB1在膿毒癥發生過程中扮演晚期促炎細胞因子的角色，參與膿毒癥的病理生理過程，介導內毒素的致死效應[8]，它可通過多條途徑促使炎癥反應增強，最終使炎癥失控遷延[9]。研究表明，嚴重燙傷和腹腔感染后6～24h大鼠肝、肺及小腸組織HMGB1基因表達顯著增多，且一直持續至傷后72h[10]。Luan等[11]研究表明，HMGB1在重癥急癥胰腺炎大鼠腸黏膜的表達上調從6h開始，持續上升超過了48h。

臨床觀察研究也證實，HMGB1加劇炎癥反應，造成急性組織損傷，且膿毒癥患者的血清/血漿HMGB1水平上升與生存組相比，膿毒癥患者死亡組血清HMGB1水平更高，而感染性休克患者血漿HMGB1濃度與器官損傷程度相關，病情重的患者HMGB1水平增長持續時間更長[12]。本實驗結果顯示，CLP術后24h，模型組HMGB1蛋白合成明顯升高，與假手術比較差異顯著，與文獻報道相符。丹紅注射液干預后，其HMGB1含量較模型組降低，表明丹紅注射液可降低HMGB1含量。[本文受到浙江中醫藥大學一般項目（No.2010LX22）；浙江中醫藥大學附屬第三醫院一般項目（No.ZS10CA15）資助]

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（收稿：2015-05-27 修回：2015-07-13）

Effect of Danhong Injection on the Expression of Oxygen-free Radicals and HMGB1 in Heart Tissue in Rats with Sepsis

HU Dandan1,YANG Guoliang2,LOU Liming1. 1Department of Respiratory Diseases,Third Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China;2Department of Oncology,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003),China

Objective To investigate the protective effect of danhong Injection on myocardial injury in rats with sepsis and the underlying mechanism.Methods Twenty-four male Wistar rats were used to establish sepsis induced by cecal ligation and puncture（CLP）and randomly divided into 4 groups:control group,sham group,model group,and danhong injection group,with 6 rats in each group.The ultrastructure of myocardium cells was observed.The contents of malondialdehyde（MDA）and superoxidedismutase（SOD）,and the protein synthesis of high mobility group box-1 protein（HMGB1）in heart tissue were determined.Results At 24h after CLP,the MDA contents and the protein synthesis of HMGB1 in model group and danhong injection group were increased compared with sham group（MDA：5.5706±1.3251μ/mg prot and 3.9900±1.0559μ/mg prot vs 1.1506±0.1771μ/mg prot;HMGB1: 0.6074±0.0504 and 0.5010±0.1049 vs 0.1427±0.0345;all P＜0.05）,while the SOD contents decreased（10.5276± 3.0568nmol/mg prot and 15.5129±3.4425nmol/mg prot vs 20.5604±3.1312nmol/mg prot,P＜0.05）.Compared with model group,danhong injection group had lower MDA content（3.9900±1.0599μ/mg prot vs 5.5706±1.3251μ/mg prot）and HMGB1 content（0.5010±0.1049 vs 0.6074±0.0504）,and higher SOD content（15.5129±3.4425nmol/mg prot vs 10.5276±3.0568nmol/mg prot;all P＜0.05）.The mitochondrion of heart cells in model group got swelling, and most of heart cells had autopepsia.The injury of heart cells in danhong injection groups was milder than thatin model group at the same time point.Conclusion Danhong injection can protect against myocardial injury in rats with sepsis,which may be related to scavenging oxygen-free radicals and reducing the protein synthesis of HMGB1.

rats;sepsis;myocardial injury;oxygen-free radicals;HMGB1;danhong injection

浙江省自然科學基金項目（No.LY12H15004）

1浙江中醫藥大學附屬第三醫院呼吸科（杭州 310005）；2杭州市紅十字會醫院腫瘤科（杭州 310003）

胡丹丹，Tel：0571-88393530；E-mail：xyz3128@sina.com