ASPP2表達對食管癌術后療效評價意義的研究

李東 田洪超 李樹臣 牛鳳英 殷培偉

(山東新泰第二人民醫院 山東新泰 271219)

ASPP2表達對食管癌術后療效評價意義的研究

李東 田洪超 李樹臣 牛鳳英 殷培偉

(山東新泰第二人民醫院 山東新泰 271219)

目的：探討ASPP2在食管癌術后患者中的表達水平及意義，證實ASPP2對食管癌術后療效評價的可行性。探討ASPP2在食管癌組織轉變過程中的分子作用機制，ASPP2表達與食管癌患者術后療效的關系。方法：采用免疫組化方法檢測45例食管癌、20例食管良性瘤及20例正常食管組織中ASPP2、P53的表達水平。進一步分析ASPP2、P53的表達與食道癌臨床病理特征的關系。采用Spearman等級相關的方法，對ASPP2、P53的表達水平進行相關性分析。結果：三組標本組織中ASPP2、P53的表達水平比較P＜0.05，具有顯著性差異。結論：食管癌組織中ASPP2表達顯著下降，P53水平明顯增高，ASPP2、P53的表達與食管癌的直徑侵襲和淋巴結轉移有關，ASPP2、P53的異常表達是食管癌發生和發展的重要因素，ASPP2是判斷食管癌術后療效的較好指標。

食管癌;ASPP2;P53;基因;療效

食管癌(esophageal cancer)是全球內發病率極高的惡性腫瘤，占全世界食管癌死亡例數的50%以上［1］。5年生存率僅為10%-15%［2］。食管癌術后5年生存率僅為25%左右，那么怎樣才能夠讓食管癌患者術后預后有一良好的評價方法成為研究熱點［3］。ASPP2是一個新的蛋白質家族，具有促進凋亡的作用，特異性地增強p53等細胞凋亡功能，ASPP2能與p53結合并特異性增強p53與促凋亡基因啟動子的結合，從而促進細胞凋亡。本研究對此進行研究來證實ASPP2異常表達與食管癌術后轉移、發展密切相關，可以成為食管癌術后療效評估的的分子生物學特異性指標。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年6月至2014年6月本院胸外科住院的食管疾患患者手術切除的食管組織85例，其中食管癌45例，食管良性瘤20例，正常食管(取自食管良性瘤患者的瘤旁2cm以上)組織20例。每例均有完整的臨床資料，其中男性35例，女性30例。食管癌組平均年齡61.5(45-78)歲，鱗狀細胞癌35例、腺癌5例、未分化癌5例，按2001年國際抗癌聯盟TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期25例，Ⅲ期6例，Ⅳ期3例;無淋巴結轉移者16例，有淋巴結轉移者29例。食管良性瘤組男性12例、女性8例，平均年齡55.2(45-67)歲，其中平滑肌瘤10例、息肉8例、乳頭狀瘤2例。所有病例均術后常規病理檢查確診，術前均未化療、放療。

1.2 隨機方法

本研究中所納入患者采用分層隨機分組化法，根據研究對象進入試驗時重要的臨床特征或危險因素分層(如年齡、性別、病情、疾病分期、檢驗、檢查等)，然后在每一層內進行隨機分組，最后分別合并為觀察組和對照組。以避免指定實驗研究及治療所帶來的偏差，提高患者的已知和未知特性被均衡分布到各治療組的可能性，增強各組統計學的可比性。

2.方法

2.1 標本采集

每例標本同時取材2塊，一塊中性福爾馬林固定，石蠟包埋用于免疫組化、病理確診、組織分型等;一塊備用。

2.2 P53免疫組化及檢測方法

2.2.1 載玻片的預處理

將載玻片用洗衣粉水浸泡過夜，自來水流水沖洗30min，蒸餾水沖洗3次，烤干，放入95%的乙醇中浸泡30min，干凈綢布擦干。

2.2.2 防脫片處理

用丙酮按1：50的比例稀釋APES配制成工作液，將清洗后的載玻片放入新鮮配制的APES工作液中20-30sec，取出玻片略干燥5min，再放入純丙酮溶液中刷洗2-3次，洗去未結合的APES，涼干裝盒，防塵防污染備用。

2.2.3 免疫組化染色程序

⑴組織切片依次置于二甲苯浸泡5min→二甲苯浸泡5min→100%乙醇浸泡5min→95%乙醇浸泡5min→80%乙醇浸泡5min→70%乙醇浸泡5min→自來水沖洗→蒸餾水浸泡5min;

⑵加新配制的3%H2O2于組織切片上，室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶活性;蒸餾水沖洗，PBS(PH7.2-7.4)浸泡5min;

⑶抗原熱修復：將裝有枸椽酸鹽緩沖液的玻片缸放人微波爐中加熱，切片位于液面以下;當液面出現小水泡時開始計時，8min后取出玻片缸冷卻至室溫，蒸餾水洗后，用PBS洗2min;

⑷加正常山羊血清工作液(藍色液體)封閉，室溫孵育15min，傾去勿洗;

⑸滴加1：100稀釋的鼠抗人p53單克隆抗體，4℃過夜，次日PBS洗3次，每次5min。用已知p53陽性的胃癌組織標本做陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照;

⑹滴加生物素標記的通用型二抗工作液(黃色液體)，室溫孵育30min，PBS洗3次，每次5min;

⑺滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液(橙色液體)，室溫孵育30min，PBS洗3次，每次5min;

⑻DAB即用型試劑配制：于1ml雙蒸水中加入1滴A液混勻，然后將試劑B和C各一滴加入其中再次混勻，配好后避光保存，0.5h內應用;

⑼加現配制的DAB顯色液覆蓋標本，顯色約2-5min，然后自來水充分沖洗。

2.2.4 復染和封片

蘇木素復染組織切片15-30sec，自來水沖洗，然后依次進行脫水、透明和中性樹膠封片，具體步驟依次為75%乙醇浸泡2min→85%乙醇浸泡2min→95%乙醇浸泡2min→100%乙醇浸泡2min→二甲苯Ⅰ浸泡2min→二甲苯Ⅱ浸泡2min→中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察結果。

2.2.5 免疫組化結果判定

p53蛋白的陽性顆粒在細胞核，細胞核中出現棕黃色顆粒即為陽性細胞。綜合染色強度和陽性范圍，對p53蛋白的表達進行臨床病理評分。染色強度：基本未著色、染色與背景相似者為0分，著色淺、略高于背景者為1分，中度著色明顯高于背景者為2分，強染、著色深棕色者為3分;陽性范圍：＜10%為0分，10%-24%為1分，25%-49%為2分，50%-75%為3分，＞75%為4分。染色強度和陽性范圍相加，≥2分為陽性。

2.3 ASPP2檢測方法［4］

2.3.1 將組織樣品與試劑混合，10分鐘低溫離心，棄上清，保證被檢樣品要求，同型對照管中加入熒光標記同型對照抗體，做陰性對照;待測管中加入熒光標記的一抗，做為實驗管，各加3μl(按抗體使用說明書，一抗可做選擇幾個梯度1：20、50、100倍稀釋)混勻即可。

2.3.2 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。

2.3.3 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時間(參考：30min)。

2.3.4 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。

2.3.5 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

2.3.6 上機檢測，先做同型對照，用熒光顯微鏡觀察，觀察標本的特異性熒光強度。染色強度：基本未著色、染色與背景相似者為0分，著色淺、略高于背景者為1分，中度著色明顯高于背景者為2分，強染、著色深棕色者為3分;陽性范圍：＜10%為0分，10%-24%為1分，25%-49% 為2分，50%-75%為3分，＞75%為4分。染色強度和陽性范圍相加，≥2分為陽性。

2.4 統計方法

使用SPSS11.5統計軟件進行分析，所有計量資料的數據以均數士標準差(X±s)表示，計量資料比較用t檢驗，計數資料比較用X2檢驗，采用Spearman等級相關的方法，對相關性進行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

3.結果

3.1 三組標本組織中ASPP2、P53在食管癌組織中的的表達分別是11.11%(5/45);93.7(42/45)在食管良性腫瘤中表達;65%(13/20); 10.0(2/20)在正常食管組織中的表達75.0%(15/20);5.0%(1/20)

三組食管組織中ASPP2、P53表達差異有顯著性(P＜0.01)，見表1

表1 ASPP2、P53在食管癌組織、食管良性腫瘤、正常食道組織中的表達

3.2 ASPP2、P53的表達與食道癌臨床病理特征的關系比較，有淋巴結轉移者ASPP2表達較其它兩組明顯下降、P53表達明顯高其它兩組;隨著TNM分期及腫瘤大小的升高ASPP2顯著下降、P53表達明顯增加(P＜0.05)，ASPP2、P53與年齡無關(P＞0.05)，見表2

表2 ASPP2、P53的表達與食道癌臨床病理特征的關系比較［n，(%)］

3.3 ASPP2、P53在食管癌組織中的表達水平呈明顯負相關。見圖1

圖1 ASPP2、P53在食管癌組織中的表達水平呈明顯負相關

4.討論

食管惡性腫瘤的發生與發展存在著復雜多階段、多步驟的生物學變化的過程，與細胞的增殖、基因改變和凋亡調節等有著密切相關性［5］。隨著分子生物學技術的發展及在各系統腫瘤研究領域中的廣泛應用，很多學者從基因水平對食管癌的評價進行了廣泛而深入的研究，而且發現了許多意義較大的基因，P53就是目前已被明確確定的基因［6］。盡管隨著醫學科技的進步，腫瘤的治療手段日益豐富，然而令人失望的是，食管癌總體五年生存率仍然很低，預后較差，死亡率很高［7］。ASPP2作為一個腫瘤抑制基因，已成為腫瘤領域研究的熱點，前期研究發現ASPP2作為抑癌基因，在肝癌、肺癌、白血病等惡性腫瘤中發揮抑制腫瘤生長和轉移的作用，國外學者在食管癌細胞株研究中ASPP2也具有明顯表達［8］，因此本研究對三組組織進行研究對比來證實其在食管癌中的表達，從而來分析其對食管癌患者術后療效評價的作用及機制。研究顯示［9］ASPP2 是p53凋亡刺激蛋白家族是一個新的蛋白家族，ASPP2能與p53蛋白的核心區域結合，增強p53促進凋亡基因轉錄的能力，發揮抑制腫瘤的作用。ASPP2是由1128個氨基酸組成的蛋白質，能促進p53結合DNA，增強p53的促細胞凋亡功能。學者們還發現ASPP2與p53相互作用，通過調控p53的凋亡功能對抑制腫瘤生長起到重要作用［10］。ASPP2促凋亡機制是通過刺激p53家族(包括p53，p63，p73)的啟動子，增強特異啟動子的綁定與轉活目的基因的功能來完成的。染色質免疫沉淀分析顯示，在體內ASPP2的表達選擇性的提高了啟動子結合目的基因p53的活性，啟動這一抑癌基因發揮作用，促進細胞凋亡［11］。APPS2不僅能增強正常啟動因子結合目的基因，而且ASPP2的表達還能選擇性刺激p53對異位表達啟動子的轉活性［12］。最近研究表明［13］，ASPP2的一段主干序列由氨基酸序列N端截斷的一段功能單位，同樣具有調節細胞周期的能力，但是其調節轉錄和p53蛋白凋亡功能的能力較強，在一些資料中體外腫瘤細胞培養的研究中發現ASPP2可以誘導腫瘤細胞的線粒體死亡途徑，導致細胞凋亡的發生，揭示了ASPP2通過調節轉錄和p53蛋白凋亡功能活性抑制食管癌生長這一分子機制［14］。但是當食管腫瘤發生后iASPP可與ASPP2競爭性地與p53結合，抑制ASPP2的促凋亡能力及表達，從而減低P53的抑制性來促進腫瘤的發生。從本研究可以看出三組標本組織中ASPP2、P53在食管癌組織中的的表達分別是11.11%(5/45);93.7% (42/45)在食管良性腫瘤中表達;65%(13/20);10.0%(2/20)在正常食管組織中的表達75.0%(15/20);5.0%(1/20)三組食管組織中ASPP2、P53表達差異有顯著性(P＜0.01)，這也說明國外研究結果與本研究相符ASPP2、P53在食管癌組織中表達具有相關性。同時本研究進一步進行ASPP2、P53的表達與食管癌臨床病理特征的關系比較，有淋巴結轉移者ASPP2表達較其它兩組明顯下降、P53表達明顯高其它兩組;隨著TNM分期及腫瘤大小的增長ASPP2顯著下降、P53表達明顯增加(P＜0.05)，ASPP2、P53與年齡無關(P＞0.05)，更進一步證實隨著食管癌患者病情加重及治療結果ASPP2的表達明細顯降低。綜上所述，ASPP2在食管癌組織中表達明顯降低，與食管癌的侵襲和淋巴結轉移有關。是食管癌發病和進展的重要因素。APSPP與p53的表達是食管癌發生和進展的相關因素，ASPP2通過p53的相互作用，調控食管癌的發病、侵襲和轉移共同發揮著重要作用。由此可見，ASPP2在食管癌中的表達足以反應其轉移、分期緩解程度，與傳統標記物P53共同反應食管癌的預后，因此完全可以將ASPP2作為食管癌術后療效的評估指標，但是ASPP2在外周血中的表達準確性還有待進一步的研究。

［1］Lossos IS，Natkunam Y，Levy R，et al.Apoptosis stimulating protein of p53(ASPP2)expression differs in diffuse large B-cell and follicular center lymphoma：correlation with clinical outcome［J］.Leuk Lymphoma，2002，43(12)：2309-2317.

［2］Zhao J，Wu G，Bu F，et al.Epigenetic silence of ankyrin-repeat-containing，SH3-domain-containing，andproline-rich-region-containing protein1(ASPP1)and ASPP2 55 genes promotes tumor growth in hepatitis B virus-positive hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2010，51(1)：142-153.

［3］Sottocornola R，Royer C，Vives V，et al.ASPP2 binds Par-3 and controls the polarity and proliferation of neural progenitors during CNS development［J］.Dev Cell，2010，19(1)：126-137.

［4］Cobleigh MA，Tabesh B，Bitterman P，et al.Tumor gene expression and prognosis in breast cancer patients with 10 or more positive lymph nodes ［J］.Clin Cancer Res，2005，11(24 Pt 1)：8623-8631.

［5］Camatgo FD，Gokhale S，Johnnidis JB，et a1.YAP1 increases organ size and expands undiferentiated progenitor cells［J］.Curr Biol，2007，17 (23)：2054-2060.

［6］Lam-Himlin DM，Daniels JA，Gayyed MF，et al.The hippo pathway in human upper genes promotes tumor growth in hepatitis B virus-positive hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2010，51(1)：142-153.

［7］Sottocornola R，Royer C，Vives V，et al.ASPP2 binds Par-3 and controls the polarity and proliferationof neural progenitors during CNS development［J］.Dev Cell，2010，19(1)：126-137.

［8］Cong W，Hirose T，Harita，Y，et al.ASPP2 regulates epithelial cell polarity through the PAR complex［J］.CurrBiol，2010，20(15)：1408-1414.

［9］Zhao B，Lei QY，Guan KL.The Hippo-YAP pathway：new connections between regulation of organ size and cancer［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20(6)：638-646.

［10］Pan D.Hippo signaling in organ size control［J］.Genes Dev，2007，21 (8)：886-897.

［11］Buttitta LA，Edgar BA.How size is controlled：from Hippos to Yorkies ［J］.Nat Cell Biol，2007，9(11)：1225-1227.

［12］Varelas X，Sakuma R，Samavarchi-Tehrani P，et al.TAZ controls Smad nucleocyto-plasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal［J］.Nat Cell Biol，2008，10(7)：837-848.

［13］Alarcon C，Zaromytidou AI，Xi Q，et al.Nuclear CDKs drive Smad transcriptional activation and turnover in BMP and TGF-b pathways［J］.Cell，2009，139(4)：757-769.

［14］FerlayJ，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］.Int J Cancer，2010，127(12)：2893-2917.

ASPP2 expression studies on the efficacy of postoperative evaluation of the significance

Li Dong Tian HongChao LiShuChen NiuFengYeng YinPeiWei

Objective:To investigate the expression and significance ASPP2 in postoperative patients，demonstrated the feasibility of ASPP2 efficacy of postoperative evaluation.ASPP2 investigate the molecular mechanism of esophageal carcinoma during the transition，the relationship ASPP2 expression and efficacy in postoperative patients.Methods:Immunohistochemical staining was detected 45 cases of esophageal cancer，20 cases of benign esophageal tumors and 20 cases of normal esophageal tissues ASPP2，the expression level of P53.Further analysis of the relationship between expression and clinicopathological features of esophageal ASPP2，P53＇s.Using Spearman rank correlation method，the ASPP2，P53 expression level correlation analysis.Results:The three groups of tissue samples ASPP2，P53 expression level was P＜0.05，significant difference.Conclusion:esophageal carcinoma ASPP2 expression was significantly decreased，P53 levels were significantly increased in diameter invasion ASPP2，P53 expression and lymph node metastasis of esophageal cancer，ASPP2，abnormal expression of P53 is an important factor in the occurrence and development of esophageal cancer，ASPP2 is a good indicator to judge the efficacy of postoperative.

Esophageal cancer;ASPP2;P53;Gene;Efficacy

R735.1

B

1009-6019(2015)02-0007-03

李東，大學學歷，主任醫生，研究方向胸外疾病的診斷與治療