心痛泰顆粒對大鼠抗急性心肌缺血保護作用的實驗研究

鄧育兵，郭志華*，吳鐘琴，宋汝汝

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

心痛泰顆粒對大鼠抗急性心肌缺血保護作用的實驗研究

鄧育兵，郭志華*，吳鐘琴，宋汝汝

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

目的 探討心痛泰顆粒對大鼠抗急性心肌缺血的保護作用的研究。方法 將大鼠隨機分成6組，除假手術組10只外，余大鼠予以結扎大鼠冠狀動脈左前降支造成大鼠急性心肌缺血損傷模型，成模大鼠隨機分為模型組、心痛泰高、中、低劑量組及麝香保心丸組。分別給以蒸餾水、心痛泰低、中、高劑量及麝香保心丸進行灌胃2周后，觀察3個時間點模型動物心電圖ST段變化；采用ELISA法檢測血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；采用TTC染色測定心肌梗死面積；采用HE染色法觀察心肌壞死組織病理變化。結果 與假手術組比較，模型組大鼠心電圖S-T段抬高明顯（P＜0.01）提示模型復制成功，模型組血清CK、LDH和MDA的濃度明顯升高（P＜0.01），血清SOD濃度明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組有拮抗大鼠急性心肌缺血心電圖S-T段抬高的作用（P＜0.05），且能明顯降低血清CK、LDH活性和MDA濃度，升高血清SOD活性(P＜0.01)，明顯縮小心肌梗死范圍，保護心肌組織（P＜0.01）。結論 心痛泰顆粒抗急性心肌缺血心肌損傷的效果顯著，對急性心肌缺血損傷大鼠有明顯的保護作用。

心痛泰顆粒；急性心肌缺血；心肌酶譜；心肌梗死；丹參；川芎

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝異常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態[1]。大量研究已表明中醫藥具有良好的抗心肌缺血的作用，在防治胸痹心痛方面有較為明顯的優勢，中醫對心肌缺血的病機也有著深刻的認識，胸陽痹阻、氣血不暢是其主要的病機[2-3]。以往臨床表明心痛泰具有改善心肌缺血、保護心肌的功能，但其改善機制尚不清楚，本研究依據大鼠急性心肌缺血損傷模型動物實驗，從相關指標，探討心痛泰抗心肌缺血的藥理效應，為心痛泰顆粒的臨床推廣應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品

1.1.1 動物 健康清潔級SD雄性大鼠100只，體質量250～300 g，由湖南中醫藥大學實驗中心提供。動物許可證批號:SCXK(湘)2013-0004。

1.1.2 心痛泰的制備 中藥飲片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。丹參、川芎、三七、山楂、郁金、枳殼、葛根等按照適當比例，加水提取2次。一煎加8倍量水提取1.5 h；二煎加6倍量水提取1 h；合并提取液，濾過，濃縮，真空干燥制成干浸膏，粉碎制粒，加適量糊精，制成顆粒劑，后60℃以下干燥整粒成品，4℃冰箱中保存備用。根據人與鼠的體表面積換算公式，配制成心痛泰丸低、中、高劑量組，分別灌服4.32、8.65、17.29 g/（kg·d），灌胃容積為10 mL/kg。麝香保心丸:上海和黃藥業有限公司，規格:22.5 mg粒，批號:Z31020068。

1.2 主要實驗儀器

切片機KD2258（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；MOTIC顯微圖像攝影系統（麥克奧迪實業集團公司）；OLYMPUS BX43研究型正置顯微鏡（日本產）；RWD瑞沃德動物呼吸機 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；RM6280多導生理信號采集處理系統（成都儀器廠）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模與分組 100只大鼠適應性飼養7 d后開始造模，造模按文獻[4]報道的方法進行，以10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉，記錄標準Ⅱ導聯心電圖，于第2～3氣管環間行氣管橫行切開，插入氣管插管。連接呼吸機進行人工控制呼吸，呼吸頻率90次/min，潮氣量10～12 mL，呼吸比設為1∶1。左前胸去毛，順肋間隙方向于胸骨左旁第3～4肋間切開皮膚，于2～3肋骨間撐開進胸，切開心包，將心臟擠出，用1根零號醫用縫合線結扎血管縫針，進針深度控制在0.1 cm，寬度為0.1～0.2 cm，假手術組僅穿線不結扎。關胸過程中放置排氣管，關胸后，抽空胸腔積氣后拔出。恢復大鼠自主呼吸，撥出氣管內插管，氣管切口及頸部切口開放，不作縫合。造模過程中持續觀察心電圖至結扎LAD 30 min后結束。觀察S-T段抬高值:缺血0 min(觀察是否造模成功)，15 min(觀察各組S-T段抬高值的區別)，30 min(判斷各組S-T段抬高值是否具有一定的差異，從而判定各給藥組抗心肌缺血的效果)。造模過程中死亡大鼠36只，剩余64只大鼠，僅穿線不結扎的10只大鼠為假手術組（SHAM），剩余54只成模大鼠，按照隨機數字表分為5組:模型組（I/R）、心痛泰高劑量組（HDG）、心痛泰中劑量組（MDG）、麝香保心丸組 （SBPG）各11只，心痛泰低劑量組（LDG）10只。

1.3.2 實驗干預 I/R組和SHAM組灌胃等量蒸餾水，其他各組相應藥物灌胃，各組每日灌胃1次，連續灌胃2周，灌胃容量均為10 mL/kg。灌胃過程中I/R組、MDG組、HDG組、SBPG組各死亡1只。

1.3.3 血液和組織標本采集與檢測 在大鼠急性心肌缺血造模成功后，觀察心電圖30 min(即缺血30 min)完畢時，于腹主動脈取血，后取出心臟，用生理鹽水清洗瘀血。血液于3 000 r/min離心10 min，取上清液(即血清)-20℃保存，采用ELISA法按照試劑盒操作說明書操作檢測血清CK、LDH、MDA和SOD含量。

1.3.4 心肌壞死組織病理變化觀察 將組織切片置于45℃水浴中展開，用黏附有多聚賴氨酸的載玻片撈片，37℃烘干后4℃保存，載玻片上刻寫組別及粘片序號。Harris明礬蘇木精染色液染色5～10 min。水洗，去除多余的染色液。1%鹽酸酒精分化數秒。流水洗，直至組織切片充分藍化。用酸化沉淀伊紅染色液染色1～5 min。經70%、95%(2次)、100% (2次)酒精脫水各1～2 min，二甲笨透明1～2 min，共3次。中性樹脂封片。Olympus BX43研究型正置顯微鏡在放大倍數10×40下觀察心肌形態結構改變。

1.3.5 心肌梗死面積測定 采用斷頭法處死大鼠，迅速取出心臟，切除心房及右心室，放置于-20℃的冰箱中冰凍15 min，然后將左心室自心尖向心底平行于房室溝方向將左心室切成厚度相近的6片。然后置于2%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸緩沖液(pH 7.4)中孵育20 min(37.0℃)，使存活心肌染成紅色，而已壞死的心肌不染色。濾除TTC液，置于4%多聚甲醛溶液中固定保存。用數碼相機拍照，用圖像采集分析軟件測量分別測量出心肌總面積、心肌梗死面積，心肌梗死面積（%）=心肌梗死面積/心肌總面積×100%。

1.4 統計學分析

數據采用統計軟件SPSS 17.0進行統計分析。計量資料以“±s”表示，所有數據均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。兩組樣本之間的均數比較釆用t檢驗，多組樣本之間的均數比較采用方差分析，方差齊時釆用LSD法、Dunnett法；當方差不齊時采用Tamhane’s T2法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠急性缺血過程中心電圖S-T段的比較

與SHAM組比較，I/R組大鼠心電圖S-T段抬高明顯（P＜0.01），提示模型復制成功。各給藥組與I/ R組比較，心肌缺血后各時間點，S-T段值均降低，差異有統計學意義（P＜0.05），表明心痛泰有拮抗心肌缺血時S-T段抬高的作用，對急性心肌缺血大鼠的心肌缺血損傷具有保護作用。見表1。

表1 各組大鼠急性缺血過程中心電圖S-T段的比較（n=10，±s，mV）

表1 各組大鼠急性缺血過程中心電圖S-T段的比較（n=10，±s，mV）

注:與SHAM組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與I/R組比較▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。下表同。

缺血組別SHAM組I/R組LDG組MDG組HDG組SBPG組正常0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0 min 0.13±0.01 0.31±0.01** 0.25±0.02*▼0.23±0.01*▼0.21±0.01*▼0.18±0.01*▼15 min 0.14±0.02 0.41±0.03** 0.35±0.02*▼0.33±0.02*▼0.30±0.02*▼0.25±0.01*▼30 min 0.13±0.01 0.49±0.04** 0.41±0.03*▼0.38±0.04*▼0.34±0.03*▼0.32±0.02*▼

2.2 各組大鼠血清CK、LDH、SOD及MDA濃度的比較

用藥 2周后，與 SHAM組比較，I/R組血清CK、LDH的活性和MDA濃度明顯升高 (P＜0.01)，血清SOD活性明顯降低(P＜0.01)；與I/R組比較各給藥組均能明顯降低大鼠血清CK、LDH活性和MDA濃度，升高SOD活性(P＜0.01)，見表2。

表2 各組對大鼠血清CK，LDH，SOD及MDA濃度 （n=10，±s）

表2 各組對大鼠血清CK，LDH，SOD及MDA濃度 （n=10，±s）

組別SHAM組I/R組LDG組MDG組HDG組SBPG組劑量(g/mL)——0.43 0.86 1.73 1.41 CK（ng/L）2 456.68±187.61 5 575.04±324.05** 5 162.56±170.98**▼▼4 462.09±95.22**▼▼3 760.76±112.80**▼▼2 947.75±192.86**▼▼LDH（ng/L）28.31±1.60 62.56±1.88** 56.65±1.60**▼▼50.09±1.71**▼▼40.92±2.33**▼▼34.83±1.80**▼▼SOD（U/L）240.57±9.67 108.04±4.74** 149.30±10.24**▼▼162.27±10.38**▼▼192.70±7.04**▼▼211.07±14.24**▼▼MDA濃度（nmol/L）3.10±0.27▼▼6.13±0.39** 5.19±0.16**▼▼4.57±0.14**▼▼4.17±0.16**▼▼3.68±0.35**▼▼

2.3 各組大鼠心肌缺血梗死面積的比較

灌胃2周后，SHAM組未見梗死區域，與I/R組相比，各用組的心肌梗死面積均有縮小，差異具有統計學意義（P＜0.01），與LDG組相比，MDG、HDG、SBPG組梗死面積有減小，差異具有統計學意義（P＜0.01），而MDG、HDG、SBPG組三者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 用藥2周后各組大鼠心肌梗死面積比較 （n=10，±s）

表3 用藥2周后各組大鼠心肌梗死面積比較 （n=10，±s）

注:與I/R組比較▼▼P＜0.01；與LDG組比較**P＜0.01。

組別I/R組LDG組MDG組HDG組SBPG組心肌總面積（μm2）0.0123±0.0002 0.0101±0.0001▼▼0.0097±0.0001▼▼** 0.0089±0.0001▼▼** 0.0075±0.0001▼▼**心肌梗死面（μm2）0.0091±0.0001 0.0062±0.0001▼▼0.0048±0.0001▼▼** 0.0034±0.0001▼▼** 0.0023±0.0001▼▼**梗死面積比（%）73.98±3.38 61.37±0.45▼▼49.48±2.65▼▼** 38.20±3.44▼▼** 30.67±4.09▼▼**

2.4 心痛泰對急性缺血大鼠壞死心肌組織學的影響

用藥2周后大鼠缺血心肌區心肌組織形態變化:SHAM組心肌細胞排列規則，少量細胞輕度水腫，細胞間質分布較均勻，有少量炎細胞浸潤；I/R組心肌細胞排列紊亂，細胞水腫變性，間質增寬，較多炎細胞浸潤，梗死區可見大量纖維化；LDG組心肌細胞排列與I/R組比較稍規整，較多心肌細胞水腫變性，間質增寬，較多炎細胞浸潤，部分心肌梗死區可見纖維化；MDG組心肌細胞排列與I/R組相比規則，部分心肌細胞水腫變性，間質可見中等炎細胞浸潤，心肌梗死區可見較少纖維化；HDG組心肌細胞排列較I/R組規則，細胞輕度水腫，變性程度明顯減輕；間質少量炎細胞浸潤，心肌梗死區可見少量纖維化改變；SBPG組心肌細胞排列較規整，部分細胞水腫，與I/R組相比，心肌細胞變性程度減輕，間質少量炎細胞浸潤，梗死區可見少量纖維化改變。見圖1。

3 討論

心肌缺血是指當冠脈供血與心肌的需血之間失去平衡導致不能支持心臟正常工作的一種病理狀態，可引起心絞痛、心肌梗死等嚴重疾病。心肌缺血時，冠脈血流量不能滿足心肌代謝需要，引起心肌急劇的、暫時的缺血缺氧，心肌內聚集過多的酸性或多肽類代謝物質，從而刺激心臟自主神經引起心絞痛[5]。同時，在缺血過程中磷脂酶激活，產生具有膜活性的游離脂肪酸，破壞細胞膜，并釋放大量兒茶酚胺，游離脂肪酸產生，以及白細胞釋放的自由基均能導致細胞質膜損傷和通透性增加，而引起心肌酶的異常[6]。CK、LDH、MDA和SOD是臨床上和實驗研究公認的對心肌缺血有診斷意義的酶[7]，可作為判斷心肌缺血損傷程度的指標。心肌缺血的最根本的防治措施仍然是改善血液供應，降低心臟耗氧，通過清除或對抗有害物質對心肌的不良影響以保護心肌。

圖1 各組大鼠心肌組織形態圖（HE，×400）

中醫歷代醫家將心肌缺血歸于 “胸痹”、“心痛”、“真心痛”等范疇[8]，其主要的病機為胸陽痹阻，氣血不暢，導致心脈攣急或閉塞不通。歷來中醫藥在心肌缺血的防治方面就具有重要的作用，大量的動物實驗已經證實中藥單體、方劑、中成藥及針灸具有良好的抗心肌缺血作用，然而理氣活血化瘀中藥具有更為較好的抗心肌缺血的作用，不僅可以改善患者癥狀，還可以改善心肌血供，預防心肌病理損傷，可能對冠狀動脈血管側支形成或缺血再灌注有比較理想的藥理效應[9]。心痛泰是由郭志華教授依據中醫理論結合多年的臨床實踐經驗，針對胸痹心痛氣滯血瘀的病機，自制而成治療冠心病的中藥復方制劑，本方以丹參活血祛瘀止痛，合有“血中氣藥”之稱的川芎共為君藥，三七、郁金、木香、山楂共為臣，助君藥調暢氣機祛瘀止痛，佐以枳殼、葛根，一升一降共調氣機。諸藥配伍，使胸陽振，瘀血散，氣機暢，共奏活血化瘀理氣止痛之效。氣行則血行，氣血運行通暢，心之絡脈就會得到充足的濡養，從而達到抗心肌缺血的作用。大量的前期臨床實驗顯示該方可以通過調節血管內皮細胞產生的一氧化氮和內皮素平衡等有效防治急性心肌缺血損傷[10]，并且已在臨床應用上得到了較好的反饋。

本實驗以冠心病急性心肌缺血損傷大鼠模型作為研究對象，采用前瞻性動物實驗的研究方法，運用活血化瘀、理氣止痛中藥復方制劑心痛泰進行干預，探討其抗急性心肌缺血的藥理效應。從各組心電圖及相關指標表達情況可以看出心痛泰能夠拮抗急性心肌缺血引起的心電圖S-T段的抬高，降低CK、LDH、MDA濃度，升高SOD水平，改善受損的心肌組織，減小心肌梗死而積，有明顯的抗急性心肌缺血的作用。從觀察結果看出，各治療組與I/R組相比，有明顯的減小心肌梗死范圍，改善受損心肌組織的程度，而且心痛泰顆粒與麝香保心丸組治療效果相當。提示心痛泰顆粒具有對大鼠抗急性心肌缺血的保護作用。

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（本文編輯 匡靜之）

Study of the Protective Effect of Xintongtai Granuel on Rats with Acute Myocardial Ischemia

Yu-Bing Deng,Zhi-Hua Guo*,Zhong-Qin Wu,Ru-Ru Song
(The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha，Hunan 410007，China)

Objective To investigate the protective effect of Xintaitong granule on the rats with acute myocardial ischemia.Methods The rats were randomly divided into six groups.Except for the10 rats in sham-operation group,the other rats were ligaturedleft anterior of coronary artery to establish the rat models of acute myocardial ischemia.The model rats were randomly divided into the model group,high-,medium-and low-dose of Xintongtai groups,and Shexiang Baoxin pill group, which were treatedseparately with distilled water,low-dose,medium-dose and high-dose of Xintongtai and Shexiang Baoxin pill by gavage for 2 weeks.Thechanges of ECG S-T segment at 3 time points of animal models were observed;Thecontentsof CK,LDH,MDA and SDA were detected by ELISA.The area of myocardial infarction was determined by TTC staining method; The pathological changes of myocardial necrosis tissue were observedby HE staining method.Results Compared with the shamoperation group,the S-T segment in model group rats was increased obviously(P＜0.01);The serum CK,LDH and MDA content increased significantly(P＜0.01),serum SOD content was significantly reduced(P＜0.01).Compared with the model group, the given medicine groups could against ECG S-T segment elevation of acute myocardial ischemiain rat(P＜0.05),they can significantly reduce the serum CK and LDH activity and MDA content,increase the serum SOD activity(P＜0.01),significantly reduced the size of myocardial infarct size,protect myocardial tissues (P＜0.01).Conclusion Xintongtai show obvious effect against acute myocardial ischemia myocardial injury and protective effect on rats with acute myocardial ischemia injury.

Xintongtai granule;acute myocardial ischemia;myocardial enzyme;myocardial infarction;Salvia miltiorrhiza; Szechuan Lovage

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.009

2015-05-04

鄧育兵，男，在讀碩士研究生，研究方向:中醫內科心腦血管疾病。

*郭志華，男，教授，E-mail:guozhihua112＠163.com。