五味子多糖的分離純化之技術(shù)概論

杜萍 冮怡琳 王旭 畢珊珊 邢光民

隨著我國科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我國的植物提純技術(shù)已經(jīng)取得了重要的成果。已經(jīng)應(yīng)用到醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。五味子由于其果實中含有甘、酸、辛、苦、咸等五種味道，同時又由于其生長在我國的東北地區(qū)因此也被成為北五味子。北五味子是一種木蘭科植物，他還被稱為五梅子、山花椒、玄及等等。由于北五味子內(nèi)含有一定的多糖、木脂素、揮發(fā)油、具有一定的滋補作用因此也是我國重要的重要滋補材料具有較高的醫(yī)療保健作用和很高的營養(yǎng)價值。由于北五味子具有較高的營養(yǎng)醫(yī)療價值因此在當(dāng)今的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有極高的研究價值，但是目前我國對于北五味子果實內(nèi)部含有的多糖、木脂素、揮發(fā)油的提取分離提純等技術(shù)還不夠成熟，因此為了更好的利用北五味子需要我們針對北五味子提純技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，下文對北五味子多糖提純技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，目的是為更好的將北五味子進(jìn)行營養(yǎng)價值轉(zhuǎn)換。

1、材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 提純北五味子時使用的五味子是經(jīng)過人工進(jìn)行培育養(yǎng)植的，這可以保證北五味子的質(zhì)量。北五味子要經(jīng)過干燥、清洗、烘干后備用。使用的化學(xué)材料主要有無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、三氯甲烷苯酚、木瓜蛋白酶等等。同時還有分析純；DEAE一52纖維素；SephadexS一300：

1.1.2 儀器與設(shè)備

五味子的多糖提純研究過程中需要一定的機器設(shè)備來幫助完成，其中包括了以下的幾種設(shè)備。主要有可見分光光度儀，RE一52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍離心機，紫外可見分光光度儀，SHZ—IIIB型循環(huán)水真空泵，TDL一5000B型冷凍離心機，V一1100紫外可見分光光度計，透析袋(分子截流量為1000U)，BSZ一100自動部分收集器，HL一2恒流泵，TDL一5000B型離心機，Sar—trius分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗多糖的制備

用蒸餾水將五味子在大燒杯中浸泡24小時，然后用50克的試用材料對其進(jìn)行水提實驗，這里需要注意的是水提正交實驗是需要用壓濾器對其中的濾液進(jìn)行過濾處理的，只有將濾液的濃度濃縮到一定的體積之后，在運用五倍的乙醇對其進(jìn)行沉淀處理，在放置一天之后，設(shè)置6000r／分鐘后使用離心機離心20rain，60攝氏度干燥以后對其質(zhì)量進(jìn)行稱量。此時還要用苯酚硫酸來測定一下多糖的實際含量。

1.2.2 粗多糖脫蛋白處理

我們的研究人員運用三氯乙酸法對五味子進(jìn)行了脫蛋白的處理，再處理的過程當(dāng)中需要注意，只要將中間層沒有出現(xiàn)變性的蛋白就可以了。這里用馬斯亮蘭法檢測蛋白含量，然后再用蒸餾水將多糖逐漸的進(jìn)行透析，一般透析的時間在兩天左右的時間，在經(jīng)過濃縮和沉淀之后，就可以得到黃色或者是微黃色的多糖化合物。

1.2.3 五味子均一多糖制備及純度鑒定

使用pH為6.8的蒸餾水浸泡已經(jīng)處理好的填充材料，裝柱(30emxlcm)后緩沖液平衡12小時，將上部分的樣液：50mg蒸餾水溶解的多糖濃縮液至6mL，接下來分別使用蒸餾水：0.1mol／LNaC1、0.2mol／LNaC1、0.3mol／LNaC1溶液反復(fù)洗脫，每5分鐘收集一管，5mL／管。最終收集相同鋒味以及相關(guān)的透析，最后進(jìn)行凍干處理。

而對于多糖的柱層析：主要是將溶脹好的填充料用0.1mol／L的NaC1溶液平衡12小時，在上樣之后會使用相同的例子濃度對其進(jìn)行相應(yīng)的洗脫處理，再收集了相同的鋒味之后，我們在講多糖的水溶液在紫外線分光光度計的波長上進(jìn)行相應(yīng)的掃描。收集相同峰位后，透析，濃縮，凍干。將多糖配成1mg／mL的水溶液在紫外分光光度計200～400nm波長上掃描。

2、結(jié)果

2.1 不同方法對蛋白脫除的結(jié)果與討論

使用不一樣的方法對蛋白脫除的結(jié)果可以明顯看出，與sevage法相比較三氯乙酸法的效果更加明顯并且結(jié)果較為可觀。綜合酶法與以上兩種方法相比較，三氯乙酸法與酶脫蛋白質(zhì)的效果還是很好的，因此我們的研究人員可以使用這一方法來對其進(jìn)行脫蛋白處理，一般情況下反復(fù)5次便可以了，這個時候蛋白質(zhì)含量為0.91mg／g；可以酶法與Sevag法結(jié)合時，酶解處理后，經(jīng)過7次Sevag法處理，蛋白質(zhì)含量仍為1.633mg／g，可見效果不太理想。

2.2 五味子多糖組分分離結(jié)果與討論

我們使用DEAE—cellulose52層析柱將五味子多糖進(jìn)行不同組分分離：多糖上樣后，分別用水0.1mol／LNaC1、0.2NaC1、0.3mol／LNaC1反復(fù)洗脫直到硫酸一苯酚顯現(xiàn)陰性為止，結(jié)果出現(xiàn)一個水洗峰A，以及B1、B2、B3，共計3個鹽洗峰，分別出現(xiàn)在0.1mol／L、0.2mol／L、0.3mol／L鹽洗脫100mL以后。我們可以從多糖的洗脫曲線看出，水洗峰A含量特別少，而SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII含量相對特別高。在這里水洗多糖組分是一種透明的液體，鹽洗脫組分SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII呈現(xiàn)出不同程度的黃色。

結(jié)論

我們的研究人員發(fā)現(xiàn)，在整個多糖脫蛋白的過程當(dāng)中，酶法與三氯乙酸相結(jié)合的效果機械能脫白其實是最好的，我們在經(jīng)過了酶解處理，再經(jīng)三氯乙酸一正丁醇法脫蛋白反復(fù)處理5次便可以了，這個時候蛋白質(zhì)含量是0.91mg／g，很明顯這個方法相對最好。但是酶法與Sevag法結(jié)合時，酶解處理以后，經(jīng)過了7次的Sevag法處理，蛋白質(zhì)含量依舊是1.633mg／g，可見這種方法的脫蛋白效率依舊比較差。經(jīng)過了DEAE—cellulose52層析柱吸附解析，將多糖分離成3種多糖組分SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII；經(jīng)SephadexS-300凝膠柱層析后，同樣都是對稱并且單一的峰；經(jīng)過紫外光譜的分析，SCP-BI、SCP-BII、SCP_BIII在280、260nm處沒有無吸收，這就證明它不含蛋白、多肽及核酸。于是就可以更確切證明SCP-BI、SCP-BII、SCP-B111多糖為均一組分。