五味子多糖的分離純化之技術概論

杜萍 冮怡琳 王旭 畢珊珊 邢光民

隨著我國科學技術的發展，我國的植物提純技術已經取得了重要的成果。已經應用到醫學等相關領域。五味子由于其果實中含有甘、酸、辛、苦、咸等五種味道，同時又由于其生長在我國的東北地區因此也被成為北五味子。北五味子是一種木蘭科植物，他還被稱為五梅子、山花椒、玄及等等。由于北五味子內含有一定的多糖、木脂素、揮發油、具有一定的滋補作用因此也是我國重要的重要滋補材料具有較高的醫療保健作用和很高的營養價值。由于北五味子具有較高的營養醫療價值因此在當今的醫學領域中具有極高的研究價值，但是目前我國對于北五味子果實內部含有的多糖、木脂素、揮發油的提取分離提純等技術還不夠成熟，因此為了更好的利用北五味子需要我們針對北五味子提純技術進行系統的研究，下文對北五味子多糖提純技術進行系統研究，目的是為更好的將北五味子進行營養價值轉換。

1、材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 提純北五味子時使用的五味子是經過人工進行培育養植的，這可以保證北五味子的質量。北五味子要經過干燥、清洗、烘干后備用。使用的化學材料主要有無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、三氯甲烷苯酚、木瓜蛋白酶等等。同時還有分析純；DEAE一52纖維素；SephadexS一300：

1.1.2 儀器與設備

五味子的多糖提純研究過程中需要一定的機器設備來幫助完成，其中包括了以下的幾種設備。主要有可見分光光度儀，RE一52型旋轉蒸發儀，冷凍離心機，紫外可見分光光度儀，SHZ—IIIB型循環水真空泵，TDL一5000B型冷凍離心機，V一1100紫外可見分光光度計，透析袋(分子截流量為1000U)，BSZ一100自動部分收集器，HL一2恒流泵，TDL一5000B型離心機，Sar—trius分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗多糖的制備

用蒸餾水將五味子在大燒杯中浸泡24小時，然后用50克的試用材料對其進行水提實驗，這里需要注意的是水提正交實驗是需要用壓濾器對其中的濾液進行過濾處理的，只有將濾液的濃度濃縮到一定的體積之后，在運用五倍的乙醇對其進行沉淀處理，在放置一天之后，設置6000r／分鐘后使用離心機離心20rain，60攝氏度干燥以后對其質量進行稱量。此時還要用苯酚硫酸來測定一下多糖的實際含量。

1.2.2 粗多糖脫蛋白處理

我們的研究人員運用三氯乙酸法對五味子進行了脫蛋白的處理，再處理的過程當中需要注意，只要將中間層沒有出現變性的蛋白就可以了。這里用馬斯亮蘭法檢測蛋白含量，然后再用蒸餾水將多糖逐漸的進行透析，一般透析的時間在兩天左右的時間，在經過濃縮和沉淀之后，就可以得到黃色或者是微黃色的多糖化合物。

1.2.3 五味子均一多糖制備及純度鑒定

使用pH為6.8的蒸餾水浸泡已經處理好的填充材料，裝柱(30emxlcm)后緩沖液平衡12小時，將上部分的樣液：50mg蒸餾水溶解的多糖濃縮液至6mL，接下來分別使用蒸餾水：0.1mol／LNaC1、0.2mol／LNaC1、0.3mol／LNaC1溶液反復洗脫，每5分鐘收集一管，5mL／管。最終收集相同鋒味以及相關的透析，最后進行凍干處理。

而對于多糖的柱層析：主要是將溶脹好的填充料用0.1mol／L的NaC1溶液平衡12小時，在上樣之后會使用相同的例子濃度對其進行相應的洗脫處理，再收集了相同的鋒味之后，我們在講多糖的水溶液在紫外線分光光度計的波長上進行相應的掃描。收集相同峰位后，透析，濃縮，凍干。將多糖配成1mg／mL的水溶液在紫外分光光度計200～400nm波長上掃描。

2、結果

2.1 不同方法對蛋白脫除的結果與討論

使用不一樣的方法對蛋白脫除的結果可以明顯看出，與sevage法相比較三氯乙酸法的效果更加明顯并且結果較為可觀。綜合酶法與以上兩種方法相比較，三氯乙酸法與酶脫蛋白質的效果還是很好的，因此我們的研究人員可以使用這一方法來對其進行脫蛋白處理，一般情況下反復5次便可以了，這個時候蛋白質含量為0.91mg／g；可以酶法與Sevag法結合時，酶解處理后，經過7次Sevag法處理，蛋白質含量仍為1.633mg／g，可見效果不太理想。

2.2 五味子多糖組分分離結果與討論

我們使用DEAE—cellulose52層析柱將五味子多糖進行不同組分分離：多糖上樣后，分別用水0.1mol／LNaC1、0.2NaC1、0.3mol／LNaC1反復洗脫直到硫酸一苯酚顯現陰性為止，結果出現一個水洗峰A，以及B1、B2、B3，共計3個鹽洗峰，分別出現在0.1mol／L、0.2mol／L、0.3mol／L鹽洗脫100mL以后。我們可以從多糖的洗脫曲線看出，水洗峰A含量特別少，而SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII含量相對特別高。在這里水洗多糖組分是一種透明的液體，鹽洗脫組分SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII呈現出不同程度的黃色。

結論

我們的研究人員發現，在整個多糖脫蛋白的過程當中，酶法與三氯乙酸相結合的效果機械能脫白其實是最好的，我們在經過了酶解處理，再經三氯乙酸一正丁醇法脫蛋白反復處理5次便可以了，這個時候蛋白質含量是0.91mg／g，很明顯這個方法相對最好。但是酶法與Sevag法結合時，酶解處理以后，經過了7次的Sevag法處理，蛋白質含量依舊是1.633mg／g，可見這種方法的脫蛋白效率依舊比較差。經過了DEAE—cellulose52層析柱吸附解析，將多糖分離成3種多糖組分SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII；經SephadexS-300凝膠柱層析后，同樣都是對稱并且單一的峰；經過紫外光譜的分析，SCP-BI、SCP-BII、SCP_BIII在280、260nm處沒有無吸收，這就證明它不含蛋白、多肽及核酸。于是就可以更確切證明SCP-BI、SCP-BII、SCP-B111多糖為均一組分。